in vitroおよびin vivoでリンパ球増殖を測定するための新しく改善された方法CFSE様蛍光色素を使用してin vivo

フローサイトメトリーによるリンパ球増殖を測定するために、カルボキシフルオレオレセインジアセテートサッキニミジルエステル（CFSE）の使用は、リンパ球応答を評価するために最も広く利用されているアッセイの1つになりました。CFSEの特性により、このようなタスクに理想的であり、高強度の長寿命の蛍光と最小限の細胞毒性の低い分散と共有結合した細胞に標識します。これらの点で、過去20年間の染料はCFSEを複製することができませんでした。ただし、現在、CFSEは最大7つの細胞分裂をたどることに限定されており、EGFPなどのフルオレセインと同様のスペクトル特性を持つ、ユビキトリーで利用可能なフルオレセインコンジュゲートまたは他の蛍光分子との使用とは互換性がありません。ここでは、リンパ球増殖、細胞微量バイオレット（CTV）および細胞増殖染料670（CPD）を測定するための2つの新しい蛍光色素を特徴付けます。CTVとCPDの両方が細胞を高い蛍光強度にラベル付けすることができますが、これは長寿命であり、変動性が低く、毒性が低く、in vivoでの非分配リンパ球の長期追跡に理想的であることがわかりました。細胞分裂の分析においてCFSEに代わる最高の代替品。また、細胞間染料の移動と細胞の自己蛍光が3つの異なる色素との分裂分解能にどのように影響し、in vivo追跡研究のために超明しいリンパ球を生成する3つの色素の標識条件を説明し、最大11の細胞分裂を使用すると検出される可能性があることを説明します。蛍光色素としてのCFSEおよびCTV。

The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to measure lymphocyte proliferation by flow cytometry has become one of the most widely utilised assays for assessing lymphocyte responses. The properties of CFSE make it ideal for such a task, covalently labelling cells with a long-lived fluorescence of high intensity and low variance with minimal cell toxicity. No dye in the last 20 years has been capable of replicating CFSE in these respects. However, currently CFSE is limited to following a maximum of 7 cell divisions and is not compatible for use with ubiquitously available fluorescein conjugates or other fluorescent molecules with spectral properties similar to fluorescein, such as EGFP. Here we characterise two new fluorescent dyes for measuring lymphocyte proliferation, Cell Trace Violet (CTV) and Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD), which have different excitation and emission spectra to CFSE and, consequently, are compatible with fluorescein conjugates. We found that while both CTV and CPD can label cells to a high fluorescence intensity, which is long-lived and has low variability and low toxicity and makes them ideal for long-term tracking of non-dividing lymphocytes in vivo, CTV offers possibly the best available alternative to CFSE in the analysis of cell divisions. We also describe how intercellular dye transfer and cell autofluorescence can affect division resolution with the three different dyes and describe labelling conditions for the three dyes that produce ultra-bright lymphocytes for in vivo tracking studies and allow up to 11 cell divisions to be detected when using CFSE and CTV as the fluorescent dyes.