ヘパリンセファロースカラム上の組換えヒト線維芽細胞成長因子2の固相n末端ペギル化

組換え線維芽細胞成長因子-2（FGF-2）は、創傷治癒、骨再生、神経保護など、いくつかの臨床応用で広く研究され、使用されています。溶液相における組換えヒトFGF-2（RHFGF-2）のポリ（エチレングリコール）（PEG）修飾が研究されており、in vivoの生体存在と治療効力を増加させています。ただし、溶液相戦略はサイト制御されておらず、マルチペギル化タンパク質の生成により、製品はしばしば均一ではありません。モノペジル化RhfGF-2レベルを増加させるために、rhFGF-2ペギル化のための新しい固相戦略が開発されています。rhFGF-2タンパク質をヘパリンセファロースカラムにロードし、ペギラトン反応を還元アルキル化によりPEG20 KDAブチルアルデヒドによってN末端で実行しました。Pegylated rhfgf-2は、SPセファロースアニオン交換クロマトグラフィーによって均質にほぼ均一に精製され、純度は95％以上であり、N末端配列とMaldi-Tofによって確認されたモノペギル化RhfGF-2の収率は58.3％でした。質量分析。in vitro生物物理学的および生化学的測定では、Pegylated rhfGF-2には、変化しない二次構造、受容体結合活性、細胞増殖、およびマップキナーゼ刺激活性、および生物安定性と熱安定性が改善されることが示されました。動物アッセイは、Pegylated rhfgf-2が半減期の増加と免疫原性の低下を示したことを示しました。従来の溶液相のペギル化と比較して、固相のペグ化は、反応時間、モノペジル化タンパク質の産生、および生化学的および生物学的活性の改善で有利です。

Recombinant fibroblast growth factor-2 (FGF-2) has been extensively studied and used in several clinical applications including wound healing, bone regeneration, and neuroprotection. Poly(ethylene glycol) (PEG) modification of recombinant human FGF-2 (rhFGF-2) in solution phase has been studied to increase the in vivo biostabilities and therapeutic potency. However, the solution-phase strategy is not site-controlled and the products are often not homogeneous due to the generation of multi-PEGylated proteins. In order to increase mono-PEGylated rhFGF-2 level, a novel solid-phase strategy for rhFGF-2 PEGylation is developed. RhFGF-2 proteins were loaded onto a heparin-sepharose column and the PEGylaton reaction was carried out at the N-terminus by PEG20 kDa butyraldehyde through reductive alkylation. The PEGylated rhFGF-2 was purified to near homogeneity by SP sepharose anion-exchange chromatography and the purity was more than 95% with a yield of mono-PEGylated rhFGF-2 of 58.3%, as confirmed by N-terminal sequencing and MALDI-TOF mass spectrometry. In vitro biophysical and biochemical measurements demonstrated that PEGylated rhFGF-2 has an unchanged secondary structure, receptor binding activity, cell proliferation, and MAP kinase stimulating activity, and an improved bio- and thermal stability. Animal assay showed that PEGylated rhFGF-2 has an increased half-life and reduced immunogenicity. Compared to conventional solution-phase PEGylation, the solid-phase PEGylation is advantageous in reaction time, production of mono-PEGylated protein, and improvement of biochemical and biological activity.