R6Kレプリコンプラスミドの維持のためのPIR+腸内細菌宿主の構築のための簡単な方法

背景：R6Kレプリコンは、最も研究されている細菌プラスミドレプリコンの1つです。R6Kプラスミドとそのγ起源の複製（ORI（R6Kγ））を抱える誘導体の複製は、PIR遺伝子エンコードされたπタンパク質に依存しています。もともとR6Kによってエンコードされたこのタンパク質は、通常、ORI（R6Kγ）を抱えるプラスミドの複製をサポートするように設計された宿主のトランスで提供されます。大腸菌では、これは一般に、λPIRファージによるリソゲン化または事前に決定された遺伝子座での相同組換えを介したPIRの染色体統合によって一般的に達成されます。 調査結果：ORI（R6Kγ）を含むプラスミドの宿主株の構築のための現在の方法には、PIR遺伝子の存在を選択できず、面倒で時間のかかるスクリーニング手順を必要とする手順が含まれます。この研究では、PIR+宿主株を迅速かつ信頼できる構築するためのミニTN7ベースの方法を確立しました。治癒可能なミニ-TN7送達プラスミドを使用して、野生型PIR+遺伝子とコピーアップPIR-116対立遺伝子の両方を使用して、一般的に使用されるいくつかの大腸菌クローニングおよびモビライザー株の誘導体を発現するPIRを分離しました。さらに、Salmonella enterica Serovar Typhimuriumの臨床分離株の誘導体を発現するPIR+およびPIR-116を分離しました。大腸菌とS. enterica血清型Typhimuriumの両方で、PIR+野生型またはPIR-116対立遺伝子の存在により、ORI（R6Kγ）を含むプラスミドの複製が可能になりました。 結論：ORI（R6Kγ）を含むプラスミドのS. enterica血清型Typhimurium宿主株の迅速かつ信頼性の高いエンジニアリングには、Mini-TN7システムが採用されました。Mini-TN7要素は、すべてではないにしても、ほとんどではないにしても、グラムの陰性菌に転置するため、比較的軽微な修飾により、この新しく確立された方法により、他の細菌種の工学がORI（R6Kγ）を使用したプラスミドの複製を可能にすることが初めてであると予想されます。

BACKGROUND: The R6K replicon is one of the best studied bacterial plasmid replicons. Replication of the R6K plasmid and derivatives harboring its γ origin of replication (ori(R6Kγ)) is dependent on the pir gene-encoded π protein. Originally encoded by R6K, this protein is usually provided in trans in hosts engineered to support replication of plasmids harboring ori(R6Kγ). In Escherichia coli this is commonly achieved by chromosomal integration of pir either via lysogenization with a λpir phage or homologous recombination at a pre-determined locus. FINDINGS: Current methods for construction of host strains for ori(R6Kγ)-containing plasmids involve procedures that do not allow selection for presence of the pir gene and require cumbersome and time-consuming screening steps. In this study, we established a mini-Tn7-based method for rapid and reliable construction of pir+ host strains. Using a curable mini-Tn7 delivery plasmid, pir expressing derivatives of several commonly used E. coli cloning and mobilizer strains were isolated using both the wild-type pir+ gene as well as the copy-up pir-116 allele. In addition, we isolated pir+ and pir-116 expressing derivatives of a clinical isolate of Salmonella enterica serovar Typhimurium. In both E. coli and S. enterica serovar Typhimurium, the presence of the pir+ wild-type or pir-116 alleles allowed the replication of ori(R6Kγ)-containing plasmids. CONCLUSIONS: A mini-Tn7 system was employed for rapid and reliable engineering of E. coli and S. enterica serovar Typhimurium host strains for plasmids containing ori(R6Kγ). Since mini-Tn7 elements transpose in most, if not all, Gram negative bacteria, we anticipate that with relatively minor modifications this newly established method will for the first time allow engineering of other bacterial species to enable replication of plasmids with ori(R6Kγ).