RNA形状化学のメカニズム

RNAの生物学的機能は、最終的に各ヌクレオチドの局所環境によって支配されます。プライマー伸長（形状）化学によって分析された選択的2'-ヒドロキシルアシル化は、多様な生物学的環境でヌクレオチド構造とダイナミクスを測定するための強力なアプローチです。形状試薬は、2'-ヒドロキシルのヌクレオフィル性を促進する制約のないヌクレオチドを優先的にサンプリングするため、柔軟なヌクレオチドで2'-ヒドロキシル基をアシル化します。重要な結果は、いくつかの制約されたヌクレオチドを2'-ヒドロキシル基で効率的な反応に備えている必要があるということです。そのようなヌクレオチドを特定するために、大腸菌リボソームの無傷の結晶で形状を実行し、16S rRNAの1490ヌクレオチドの反応性を監視し、形状に対して過剰反応性であり、明確に定義された結晶学の整合性を持っていたヌクレオチドを調べました。これらのコンフォメーションの分析により、2'-ヒドロキシル反応性は、複数のRNA官能基を含む一般的な塩基触媒と、ブリッジング3 'リン酸グループの2つの特定の方向によって広く促進されることが明らかになりました。ヌクレオチド類似体の研究により、これらのメカニズムが反応性を形成することを確認しました。これらの結果は、形状の反応性と局所RNAダイナミクスの関係について強力な機構的説明を提供し、この化学を利用する多くの技術における形状情報の解釈を促進します。

The biological functions of RNA are ultimately governed by the local environment at each nucleotide. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) chemistry is a powerful approach for measuring nucleotide structure and dynamics in diverse biological environments. SHAPE reagents acylate the 2'-hydroxyl group at flexible nucleotides because unconstrained nucleotides preferentially sample rare conformations that enhance the nucleophilicity of the 2'-hydroxyl. The critical corollary is that some constrained nucleotides must be poised for efficient reaction at the 2'-hydroxyl group. To identify such nucleotides, we performed SHAPE on intact crystals of the Escherichia coli ribosome, monitored the reactivity of 1490 nucleotides in 16S rRNA, and examined those nucleotides that were hyper-reactive toward SHAPE and had well-defined crystallographic conformations. Analysis of these conformations revealed that 2'-hydroxyl reactivity is broadly facilitated by general base catalysis involving multiple RNA functional groups and by two specific orientations of the bridging 3'-phosphate group. Nucleotide analog studies confirmed the contributions of these mechanisms to SHAPE reactivity. These results provide a strong mechanistic explanation for the relationship between SHAPE reactivity and local RNA dynamics and will facilitate interpretation of SHAPE information in the many technologies that make use of this chemistry.