大腸菌で発現した組換えマルトース結合タンパク質融合タンパク質における汚染NADH酸化活性の存在と除去

大腸菌で発現し、従来のアミ​​ロース樹脂ベースのアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製されたマルトース結合タンパク質（MBP）融合タンパク質における汚染性NADH酸化活性の存在が観察されました。この汚染NADH酸化活性は、MBP融合タンパク質（すなわち、I型脂肪酸シンターゼ、脂肪アシル-CoA結合タンパク質、アシル - リガーゼゼーゼゼンからのエノイル - リードターゼドメイン）として発現するクリプトスポリジウムparvumの少なくとも4つの異なる酵素で検出可能でした。NADH依存に関係なく、ポリケチドシンターゼと推定チオエステラーゼからのドメイン。ただし、融合タンパク質がHISタグを封じ込めるように設計され、NI-NTA樹脂ベースのプロトコルを使用して精製された場合、NADH酸化活性は存在しませんでした。あるいは、MBPタグのみを含むタンパク質の場合、細菌の均質化および最初のカラム洗浄中に0.1％Triton X-100および2％グリセロールをカラムバッファーに添加することにより、汚染活性を排除することができます。通常の柱と溶出緩衝液での溶出。特にネイティブ活性が低い場合、または組換えタンパク質が不活性である場合、Artifactual活性の除去は、補因子としてNADHを使用した酵素の研究では非常に価値があります。

We observed the presence of contaminating NADH oxidation activity in maltose binding protein (MBP) fusion proteins expressed in Escherichia coli and purified using conventional amylose resin-based affinity chromatography. This contaminating NADH oxidation activity was detectable with at least four different enzymes from Cryptosporidium parvum expressed as MBP-fusion proteins (i.e., an enoyl-reductase domain from a type I fatty acid synthase, a fatty acyl-CoA binding protein, the acyl-ligase domain from a polyketide synthase, and a putative thioesterase), regardless of their NADH dependence. However, contaminating NADH oxidation activity was not present when fusion proteins were engineered to contain a His-tag and were purified using a Ni-NTA resin-based protocol. Alternatively, for proteins containing only an MBP-tag, the contaminating activity could be eliminated through the addition of 0.1% Triton X-100 and 2% glycerol to the column buffer during homogenization of bacteria and first column wash, followed by an additional wash and elution with regular column and elution buffers. Removal of the artifactual activity is very valuable in the study of enzymes using NADH as a cofactor, particularly when the native activity is low or the recombinant proteins are inactive.