顆粒関連因子によるペプチジルグリシンアルファアミデートモノオキシゲナーゼ活性のpH依存性刺激

ペプチジルグリシンアルファアミデートモノオキシゲナーゼ（PAM; EC 1.14.17.3）は、グリシン固有の前駆体からのアルファアミデートペプチドの産生、完全な生物学的活動に必要なしばしば必要とする顆粒関連酵素である顆粒関連酵素です。ウシ神経介入型下垂体の粗ホモジネートにおけるPAM活性は、ペプチド基質alpha-n-ac-tyr-val-glyに最適な酸性pHを持っています。精製中、pH最適シフトはシフトします。精製されたBPAMの能力を回復する要因は、pH 6でアルファアミデート産物を生産する能力を特定しました。ラットの前葉下垂体では、この因子（PAM活性の刺激装置のスパムを示す）は、ゲルろ過により44 Kのmol wtを持つ可溶性タンパク質でした。その刺激活動は、トリプシン消化または沸騰によって減少または排除される可能性があります。スパムは、見かけのVMAXを増加させ、ペプチド基質の見かけのミカエリス・メンテン定数（km）を減少させることにより、酸性pHでPAM活性を刺激しました。PAMのように、スパムアクティビティは分泌顆粒にローカライズされます。さまざまなラット組織のスパム活性のレベルは、PAM活性のレベルと密接に相関しており、心房、前葉下垂、ニューロインテルメディー下垂体のスパム活性が最も大きくなりました。可溶性と膜画分の間のPAMとスパムの分布も密接に相関していました。全長BPAM前駆体をコードする相補的なDNA（cDNA）をトランスフェクトしたATT-20細胞株では、SPAMおよびPAM活性の両方が野生型細胞と比較して増加しました。両方の活性は、アンチセンスラット（R）PAM mRNAを発現する細胞株で減少しました。顕著なコントラストでは、BPAMの切り捨てられた可溶性型をコードするcDNAでトランスフェクトされたATT-20細胞株は、PAM活性のレベルが上昇しましたが、野生型細胞と比較してスパム活性のレベルは増加しませんでした。これらの結果は、スパムアクティビティがフルレングスPAMの発現と密接に関連していることを示唆しています。PAMとSPAMの相互作用は、特に低微小pHでの生物活性ペプチドの合成の調節のための部位を表している可能性があります。

Peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase (PAM; EC 1.14.17.3) is a granule-associated enzyme that catalyzes the production of alpha-amidated peptides from their glycine-extended precursors, a posttranslational modification often required for full biological activity. PAM activity in crude homogenates of bovine neurointermediate pituitary has an acidic pH optimum for the peptide substrate alpha-N-Ac-Tyr-Val-Gly. During purification, the pH optimum shifts, so that purified bovine (b)PAM exhibits an alkaline pH optimum for this substrate with virtually no activity below pH 6.5. A factor that restores the ability of purified bPAM to produce alpha-amidated products at pH 6 was identified. In rat anterior pituitary this factor (denoted SPAM for stimulator of PAM activity) was a soluble protein with a mol wt of 44 K by gel filtration; its stimulatory activity could be reduced or eliminated by trypsin digestion or boiling. SPAM stimulated PAM activity at acidic pH by increasing the apparent Vmax and decreasing the apparent Michaelis-Menten constant (Km) for the peptide substrate. Like PAM, SPAM activity is localized to the secretory granule. Levels of SPAM activity in various rat tissues correlated closely with levels of PAM activity, with the greatest amount of SPAM activity in atrium, anterior pituitary, and neurointermediate pituitary. The distribution of PAM and SPAM between soluble and membrane fractions also correlated closely. In AtT-20 cell lines transfected with a complementary DNA (cDNA) encoding the full-length bPAM precursor, both SPAM and PAM activities were increased compared to wild type cells; both activities were decreased in a cell line expressing an antisense rat (r)PAM mRNA. In marked contrast, an AtT-20 cell line transfected with a cDNA encoding a truncated, soluble form of bPAM had elevated levels of PAM activity, but levels of SPAM activity were not increased compared to wild-type cells. These results suggest that SPAM activity is closely linked to the expression of full-length PAM. The interaction of PAM and SPAM may represent a site for regulation of the synthesis of bioactive peptides, particularly at low intragranular pH.