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Paecilomyces Thermophilaからの新規β-グルコシダーゼ遺伝子（PTBGLU3と呼ばれる）をクローン化して配列決定しました。PTBGLU3には、2,557 bpのオープンリーディングフレームがあり、計算された分子量が90.9 kDaの858アミノ酸をコードしています。成熟したポリペプチドのアミノ酸配列は、ペニシリウムpurpuRogenumのβ-グルコシダーゼを特徴づけたグリコシド加水分解酵素（GH）ファミリー3に最高の同一性（70％）を共有しました。シグナルペプチドのないPtbGlu3をPPIC9Kベクターにクローン化し、Pichia Pastorisで活性細胞外β-グルコシダーゼ（PTBGLU3）として正常に発現しました。274.4 U/mLの高い活性は、β-グルコシダーゼの最も高い報告収量である高細胞密度発酵によって得られました。組換え酵素は、3.3倍精製と68.5％の回復で均一性に精製されました。酵素の分子量は、SDS-PAGEで116 kDa、ゲルろ過によって198.2 kDaと推定され、それが二量体であることを示しています。精製酵素の最適な活性は、pH 6.0および65°Cで観察され、60°Cまで安定していました。酵素は、PNP-β-D-グルコピラノシド、セルオリゴ糖、紳士、アミグダリンおよびサリシンに対して高い特異的活性を示し、リチェナンとラミナリンに対する比較的低い活性を示しました。現在の結果は、β-グルコシダーゼの工業生産の改善に貢献するはずです。
Paecilomyces Thermophilaからの新規β-グルコシダーゼ遺伝子（PTBGLU3と呼ばれる）をクローン化して配列決定しました。PTBGLU3には、2,557 bpのオープンリーディングフレームがあり、計算された分子量が90.9 kDaの858アミノ酸をコードしています。成熟したポリペプチドのアミノ酸配列は、ペニシリウムpurpuRogenumのβ-グルコシダーゼを特徴づけたグリコシド加水分解酵素（GH）ファミリー3に最高の同一性（70％）を共有しました。シグナルペプチドのないPtbGlu3をPPIC9Kベクターにクローン化し、Pichia Pastorisで活性細胞外β-グルコシダーゼ（PTBGLU3）として正常に発現しました。274.4 U/mLの高い活性は、β-グルコシダーゼの最も高い報告収量である高細胞密度発酵によって得られました。組換え酵素は、3.3倍精製と68.5％の回復で均一性に精製されました。酵素の分子量は、SDS-PAGEで116 kDa、ゲルろ過によって198.2 kDaと推定され、それが二量体であることを示しています。精製酵素の最適な活性は、pH 6.0および65°Cで観察され、60°Cまで安定していました。酵素は、PNP-β-D-グルコピラノシド、セルオリゴ糖、紳士、アミグダリンおよびサリシンに対して高い特異的活性を示し、リチェナンとラミナリンに対する比較的低い活性を示しました。現在の結果は、β-グルコシダーゼの工業生産の改善に貢献するはずです。
A novel β-glucosidase gene (designated PtBglu3) from Paecilomyces thermophila was cloned and sequenced. PtBglu3 has an open reading frame of 2,557 bp, encoding 858 amino acids with a calculated molecular mass of 90.9 kDa. The amino acid sequence of the mature polypeptide shared the highest identity (70%) to a glycoside hydrolase (GH) family 3 characterized β-glucosidase from Penicillium purpurogenum. PtBglu3 without the signal peptides was cloned into pPIC9K vector and successfully expressed in Pichia pastoris as an active extracellular β-glucosidase (PtBglu3). High activity of 274.4 U/ml was obtained by high cell-density fermentation, which is by far the highest reported yield for β-glucosidase. The recombinant enzyme was purified to homogeneity with 3.3-fold purification and a recovery of 68.5%. The molecular mass of the enzyme was estimated to be 116 kDa by SDS-PAGE, and 198.2 kDa by gel filtration, indicating that it was a dimer. Optimal activity of the purified enzyme was observed at pH 6.0 and 65 °C, and it was stable up to 60 °C. The enzyme exhibited high specific activity toward pNP-β-D-glucopyranoside, cellooligosaccharides, gentiobiose, amygdalin and salicin, and relatively lower activity against lichenan and laminarin. The present results should contribute to improving industrial production of β-glucosidase.
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