ウシ血清アルブミンは、GCリッチテンプレートのポリメラーゼ連鎖反応の収率の増加に対する有機溶媒の効果をさらに高めます

背景：標準的な強力な分子生物学技術である一方で、PCRの高GCリッチDNAサンプルの増幅への応用は、依然として限られた収量と反応の特異性が低いことを含む課題を呈しています。DMSOやホルモアミドを含む有機溶媒は、多くの場合、高GC含有量（GC> 60％）DNA配列の増幅の効率を高めるために添加剤として採用されています。ウシ血清アルブミン（BSA）は、フェノール性化合物などの潜在的な阻害剤を含む環境サンプルからのテンプレートのPCR増幅だけでなく、制限酵素消化を含むいくつかの用途で添加剤として使用されています。 調査結果：0.4 kbから7.1 kbのサイズの範囲のGCリッチDNAターゲットのPCR増幅収率の有意な増加は、BSAをDMSOおよびホルムアミドとともに共additiveとして使用することにより達成されました。特に、BSAの効果の向上は、初期のPCRサイクルで発生し、BSA添加はPCRの収量や特異性に有害な影響を与えません。PCRがセットアップされ、10サイクルごとにサイクリングパラメーターが一時停止してBSAの補給を可能にし、BSAと有機溶媒を組み合わせて、溶媒のみを使用した条件と比較して有意に高い収率を生成しました。有機溶媒の存在下でのBSAの共拡張効果は、部位指向の突然変異誘発や拡張PCRのオーバーラップなど、他のPCRアプリケーションでも得られました。 結論：BSAは、有機溶媒、DMSO、またはホルムアミドと組み合わせて使用すると、PCR増幅収率を大幅に向上させます。BSA強化効果は、GC含有量が高いDNAテンプレートと広いサイズの範囲にまたがるいくつかのPCRアプリケーションで得られました。反応バッファーに追加すると、DNAのサイズに関係なく、PCRの最初のサイクルでBSAの効果を促進することが見られました。ここで概説する戦略は、広いサイズの範囲でGCリッチDNAターゲットのPCR増幅の効率を高めるための費用対効果の高い代替手段を提供します。

BACKGROUND: While being a standard powerful molecular biology technique, applications of the PCR to the amplification of high GC-rich DNA samples still present challenges which include limited yield and poor specificity of the reaction. Organic solvents, including DMSO and formamide, have been often employed as additives to increase the efficiency of amplification of high GC content (GC > 60%) DNA sequences. Bovine serum albumin (BSA) has been used as an additive in several applications, including restriction enzyme digestions as well as in PCR amplification of templates from environmental samples that contain potential inhibitors such as phenolic compounds. FINDINGS: Significant increase in PCR amplification yields of GC-rich DNA targets ranging in sizes from 0.4 kb to 7.1 kb were achieved by using BSA as a co-additive along with DMSO and formamide. Notably, enhancing effects of BSA occurs in the initial PCR cycles with BSA additions having no detrimental impact on PCR yield or specificity. When a PCR was set up such that the cycling parameters paused after every ten cycles to allow for supplementation of BSA, combining BSA and organic solvent produced significantly higher yields relative to conditions using the solvent alone. The co-enhancing effects of BSA in presence of organic solvents were also obtained in other PCR applications, including site-directed mutagenesis and overlap extension PCR. CONCLUSIONS: BSA significantly enhances PCR amplification yield when used in combination with organic solvents, DMSO or formamide. BSA enhancing effects were obtained in several PCR applications, with DNA templates of high GC content and spanning a broad size range. When added to the reaction buffer, promoting effects of BSA were seen in the first cycles of the PCR, regardless of the size of the DNA to amplify. The strategy outlined here provides a cost-effective alternative for increasing the efficiency of PCR amplification of GC-rich DNA targets over a broad size range.