マウス3T3-L1脂肪細胞細胞分化モデル：QPCR遺伝子発現分析のための検証された参照遺伝子

背景：mRNAレベルでの遺伝子発現の分析、リアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）を使用して、内部コントロールとして参照遺伝子（RG）が強制的に必要です。しかし、増加する証拠は、RG発現が実験条件下でかなり異なる可能性があることを示しています。脂肪細胞への末端分化中に、3T3-L1細胞株モデルで適切なRGSパネルを使用することを求めました。この目的のために、広く使用されている7つのRG mRNAのパネルの発現レベルは、QRT-PCRによって測定されました。評価された7つのRGSは、β-アクチン（ACTB）、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（GAPDH）、ヒポキサンチンホスリボシルトランスフェラーゼI（HPRT）、ATP合成酵素H+輸送ミトコンドリアF1複合ベータサブユニット（ATP-5B）、Tyr5B）、Tyrisine 3-Monooxyin/トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド（YWHAZ）、オクタマー結合タンパク質（nonO）を含む非プードメイン、および大きなリボソームタンパク質L13A（RPL）。 方法論/主要な調査結果：3つのExcelアプリケーション、Genorm、Normfinder、およびBestKeeperを使用して、潜在的なRGの数と安定性は、3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化中に大きく異なることが観察されました。QRT-PCRを使用したmRNA発現分析により、分化プログラム全体では、ノンオ発現のみが比較的安定していることが明らかになりました。さらに、容認できるほど安定したRGセットは、全体的な分化プロセスの位相（つまり、有糸分裂クローンの拡大と端子分化段階）によって異なっていました。RPL、ACTB、およびYWHAZは末端分化に適していますが、ATP-5BとHPRTは有糸分裂クローンの拡大中に適しています。 結論：我々の結果は、正確なデータ分析を確保するために、脂肪生成のさまざまな明確に定義された段階で適切なRGの選択に特別な注意を払わなければならないこと、およびいくつかのRGの使用が絶対に必要であることを示しています。その結果、我々のデータは初めて、有糸分裂クローンの拡大中に最も適切なRGSがATP-5B、nono、およびHPRTであり、末端分化中に最も適切なRGは、nono、rpl、actb、ywhazであることが示されています。

BACKGROUND: Analysis of gene expression at the mRNA level, using real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR), mandatorily requires reference genes (RGs) as internal controls. However, increasing evidences have shown that RG expression may vary considerably under experimental conditions. We sought for an appropriate panel of RGs to be used in the 3T3-L1 cell line model during their terminal differentiation into adipocytes. To this end, the expression levels of a panel of seven widely used RG mRNAs were measured by qRT-PCR. The 7 RGs evaluated were ß-actin (ACTB), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), hypoxanthine phosphoribosyl-transferase I (HPRT), ATP synthase H+ transporting mitochondrial F1 complex beta subunit (ATP-5b), tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5- monooxygenase activation protein, zeta polypeptide (Ywhaz), Non-POU-domain containing octamer binding protein (NoNo), and large ribosomal protein L13a (RPL). METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Using three Excel applications, GeNorm, NormFinder and BestKeeper, we observed that the number and the stability of potential RGs vary significantly during differentiation of 3T3-L1 cells into adipocytes. mRNA expression analyses using qRT-PCR revealed that during the entire differentiation program, only NoNo expression is relatively stable. Moreover, the RG sets that were acceptably stable were different depending on the phase of the overall differentiation process (i.e. mitotic clonal expansion versus the terminal differentiation phase). RPL, ACTB, and Ywhaz, are suitable for terminal differentiation, whereas ATP-5b and HPRT, are suitable during mitotic clonal expansion. CONCLUSION: Our results demonstrate that special attention must be given to the choice of suitable RGs during the various well defined phases of adipogenesis to ensure accurate data analysis and that the use of several RGs is absolutely required. Consequently, our data show for the first time, that during mitotic clonal expansion, the most suitable RGs are ATP-5b, NoNo and HPRT, while during terminal differentiation the most suitable RGs are, NoNo, RPL, ACTB and Ywhaz.