ウラシルDNAグリコシラーゼによる治療により、ホルマリン固定がん生検から分離されたDNAからの配列アーチファクトの劇的な減少

非凍結性配列アーチファクトは、形式的およびパラフィン包埋（FFPE）組織からのDNAで頻繁に検出されます。ただし、アーティファクトの根本的な原因がよく理解されていないため、FFPE DNAからの配列アーチファクトを減らすための合理的な戦略は開発されていません。ウラシルへのシトシン脱アミノ化は古代DNAのDNA損傷の一般的な形態であるため、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）によるFFPE DNAの治療がC> T（およびG> A）配列の減少につながるかどうかを調べることに着手しました。アーティファクト。高分解能融解（HRM）ベースのアッセイにおけるヘテロドゥプレックス形成は、FFPE DNAサンプルの配列バリアントの検出に使用されました。AKT1遺伝子のエクソン4のE17K変異のスクリーニングのために偽陽性のHRM結果を与えたサンプルのセットを分析のために選択しました。これらのサンプルのシーケンスは、複数の非複製可能なc：g> t：Aアーティファクトを示しました。PCR増幅の前にFFPE DNAをUDGで処理すると、HRMとシーケンス分析の両方で示されるように、シーケンスアーチファクトが非常に顕著に減少し、ウラシル病変がシーケンスアーチファクトの主な原因であることを示しています。同じサンプルセットのBRAF V600領域と別のサンプルセットでEGFR Exon 19についても同様の結果が示されました。UDG治療は、真のKras Codon 12およびTrue EGFR Exon 19および20の変異の検出に影響を与えなかったため、FFPE DNAのアーティファクトの形成を特異的に抑制しました。FFPE DNAのウラシルは、シーケンスアーチファクトのかなりの割合につながると結論付けています。これらは、熱サイクリングを開始する直前と同じチューブ内で、容易に実行できる単純なUDG前処理によって最小化できます。HRMは、損傷の程度とUDG治療の有効性の両方を監視する便利な方法です。これらの発見には、FFPE DNAがパーソナライズ医療戦略を導く変異研究の主要な遺伝物質としてFFPE DNAが使用され、突然変異を検出するための簡単な効果的な戦略が必要であるがん診断に即時かつ重要な意味があります。

Non-reproducible sequence artefacts are frequently detected in DNA from formalinfixed and paraffin-embedded (FFPE) tissues. However, no rational strategy has been developed for reduction of sequence artefacts from FFPE DNA as the underlying causes of the artefacts are poorly understood. As cytosine deamination to uracil is a common form of DNA damage in ancient DNA, we set out to examine whether treatment of FFPE DNA with uracil-DNA glycosylase (UDG) would lead to the reduction of C>T (and G>A) sequence artefacts. Heteroduplex formation in high resolution melting (HRM)-based assays was used for the detection of sequence variants in FFPE DNA samples. A set of samples that gave false positive HRM results for screening for the E17K mutation in exon 4 of the AKT1 gene were chosen for analysis. Sequencing of these samples showed multiple non-reproducible C:G>T:A artefacts. Treatment of the FFPE DNA with UDG prior to PCR amplification led to a very marked reduction of the sequence artefacts as indicated by both HRM and sequencing analysis, indicating that uracil lesions are the major cause of sequence artefacts. Similar results were shown for the BRAF V600 region in the same sample set and EGFR exon 19 in another sample set. UDG treatment specifically suppressed the formation of artefacts in FFPE DNA as it did not affect the detection of true KRAS codon 12 and true EGFR exon 19 and 20 mutations. We conclude that uracil in FFPE DNA leads to a significant proportion of sequence artefacts. These can be minimised by a simple UDG pretreatment which can be readily carried out, in the same tube, as the PCR immediately prior to commencing thermal cycling. HRM is a convenient way of monitoring both the degree of damage and the effectiveness of the UDG treatment. These findings have immediate and important implications for cancer diagnostics where FFPE DNA is used as the primary genetic material for mutational studies guiding personalised medicine strategies and where simple effective strategies to detect mutations are required.