BUMEメソッド：新規自動化されたクロロホルムを含まない96-Well血漿のための総脂質抽出法

生物学的サンプルからの脂質抽出は、脂質研究における重要でしばしば退屈な前分裂ステップです。主に自動化基準に基づいて、標準の96ウェルロボットと互換性のある血漿のための新しいクロロホルムを含まない総脂質抽出法であるBume法を開発しました。わずか60分で、96のサンプルを、一般的に分析された脂質クラスの脂質プロファイルで自動的に抽出できます。クロロホルムベースの参照法を使用して得られるものと同様またはより良い絶対回復とともに。脂質回収率は、開発された抽出プロトコルを使用して、調査したすべての脂質について10〜100 µLの血漿から線形でした。BUMEプロトコルには、300 µlブタノールへの血漿の初期一相抽出：メタノール（BUME）混合物（3：1）に続いて、300 µLヘプタンへの2相抽出：300 µL 1％を使用した酢酸エチル（3：1）が含まれます。緩衝液としての酢酸。調査された脂質には、最も豊富な血漿脂質クラス（例：コレステロールエステル、遊離コレステロール、トリアシルグリセロール、ホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリン）、およびセラミド、ジアシルセロリロール、およびライジョフホリピドを含む豊富ではあるが生物学的に重要な脂質クラスが含まれていました。この新しい方法は、私たちの研究室で正常に実装されており、現在毎日使用されています。完全に自動化されたハイスループットのBUMEメソッドは、クロロホルムベースの方法に取って代わり、人間と環境の両方の資源を節約できると結論付けています。

Lipid extraction from biological samples is a critical and often tedious preanalytical step in lipid research. Primarily on the basis of automation criteria, we have developed the BUME method, a novel chloroform-free total lipid extraction method for blood plasma compatible with standard 96-well robots. In only 60 min, 96 samples can be automatically extracted with lipid profiles of commonly analyzed lipid classes almost identically and with absolute recoveries similar or better to what is obtained using the chloroform-based reference method. Lipid recoveries were linear from 10-100 µl plasma for all investigated lipids using the developed extraction protocol. The BUME protocol includes an initial one-phase extraction of plasma into 300 µl butanol:methanol (BUME) mixture (3:1) followed by two-phase extraction into 300 µl heptane:ethyl acetate (3:1) using 300 µl 1% acetic acid as buffer. The lipids investigated included the most abundant plasma lipid classes (e.g., cholesterol ester, free cholesterol, triacylglycerol, phosphatidylcholine, and sphingomyelin) as well as less abundant but biologically important lipid classes, including ceramide, diacylglycerol, and lyso-phospholipids. This novel method has been successfully implemented in our laboratory and is now used daily. We conclude that the fully automated, high-throughput BUME method can replace chloroform-based methods, saving both human and environmental resources.