代謝標識とフローサイトメトリーによる細胞周期の進行速度論の測定

細胞周期のさまざまな相を通じて開始とその後の進行の正確な制御は、増殖細胞で最も重要です。細胞周期分裂は、成長と繁殖の不可欠な部分であり、主要な細胞周期成分の沈着剤は発がんの沈殿イベントに関係しています。抗がん療法の分子薬は、細胞周期分裂の調節と調整の原因となる生物学的経路を頻繁に標的にします。細胞周期の動態は細胞型によって変化する傾向がありますが、マイトジェンと成長因子の発現の一貫したパターンにより、細胞周期の4つの段階間の細胞の分布は特定の細胞株内でかなり一貫しています。遺伝毒性イベントやその他の細胞ストレッサーは、細胞周期の進行の一時的なブロックをもたらす可能性があり、特定の細胞周期段階で停止または一時的な一時停止をもたらし、適切な反応メカニズムの扇動を可能にします。細胞周期の進行段階に関連して細胞集団の挙動を実験的に観察する能力は、細胞生物学の重要な進歩です。有糸分裂の揺れ、差動遠心分離、またはフローサイトメトリーベースのソートなどの一般的な手順は、細胞周期の特定の段階で細胞を分離するために使用されます。これらの分画し、細胞周期の位相豊富な集団は、実験的治療にさらされます。分離された画分の収量、純度、および実行可能性は、これらの物理的分離方法を使用してしばしば妥協することができます。同様に、細胞集団の分離と実験的治療の開始との間の時間経過は、分画細胞が選択された細胞周期段階から進行する可能性があり、これらの実験の実装と解釈の成功に大きな課題をもたらす可能性があります。細胞周期段階を研究する他のアプローチには、化学物質の使用が細胞を同期することが含まれます。各細胞周期段階の主要な代謝プロセスの化学阻害剤による細胞の処理は、細胞周期の進行を次の段階にブロックするのに役立ちます。たとえば、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤ヒドロキシ尿素は、DNAの構成要素であるデオキシヌクレオチドの供給を制限することにより、G1/S接合部で細胞を停止します。他の顕著な化学物質には、G1停止のためのポリメラーゼアルファ阻害剤であるアブジジコリンによる治療、コルヒチンとノコダゾールによる治療が含まれます。どちらも、M相の有糸分裂紡錘体形成を妨害し、最後に、DNA連鎖ターミネーター5-フルオロデオキシリジンでの治療を開始します。S相停止。これらの化学物質による治療は、特定のフェーズで細胞全体を同期させる効果的な手段です。化学物質を除去すると、細胞は細胞周期に再び結合します。細胞周期ブロッキング化学からの放出後の試験剤の治療により、誘発された薬物反応が均一な細胞周期段階固有の集団からのものであることが保証されます。ただし、化学同期の多くは既知の遺伝毒性化合物であるため、さまざまな応答経路の関与（同期対テストエージェントへ）の関与をからかうことは困難です。ここでは、DNA複製段階から娘細胞の分裂と分離までの進行を通じて、アクティブにサイクリング細胞の亜集団を追跡するための代謝標識方法について説明します。フローサイトメトリーの定量化と相まって、このプロトコルは、他の細胞周期同期方法論に一般的に関連する機械的または化学的に誘導された細胞ストレスがない場合、細胞周期の運動進行を測定することができます。次のセクションでは、方法論と生物医学研究のいくつかのアプリケーションについて説明します。

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments. Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.