エステラーゼにおける新しい機能の進化：単純なアミノ酸置換は、より大きなパラログに存在する活性を可能にしますbioh

遺伝子の複製と発散は、新しい活動の進化に不可欠なプロセスです。発散は、単純なアミノ酸残基の置換​​を含む、または劇的なものであるため、より大きな構造要素が挿入、削除、または再配置されるように、徐々に緩やかになる場合があります。いくつかの実験的証拠によってサポートされている広大なタンパク質配列比較は、特定の触媒活性が進化するには大きな構造的修正が必要であると主張しています。ただし、これらの活動が段階的な変更によって達成できなかったかどうかは明らかではありません。興味深いことに、触媒の乱交は根本的な進化的役割を果たす可能性があります。酵素の一次活動に影響を与えない単純なアミノ酸残基置換によって、既存の二次活動を増加させることができます。酵素の無差別プロファイルは、遺伝的ドリフトによって徐々に変更され、複製前に選択できる潜在的に有用な活動のプールを作成することができます。この研究では、ランダムな突然変異誘発とin vivo選択を使用して、小さなタンパク質である緑膿菌PAO1カルボキシレステーゼPA3859を進化させて、ビオチン生合成に関与するはるかに大きなパラログであるBioHの機能を達成しました。Biohは、聴力栄養補完により進化した酵素活性に非常に敏感な選択を提供するため、ターゲット活動として選択されました。直接的な進化の2サイクルしかなかった後、ビオチン補助栄養を効率的に補完する能力を備えた変異体が選択されました。in vivoおよびin vitroの特性評価は、私たちの変異タンパク質の1つの活性が野生型バイオ酵素の活性と類似していることを示しました。我々の結果は、離散アミノ酸置換により、より大きなタンパク質に存在する酵素活性を進化させることが可能であることを示しています。

Gene duplication and divergence are essential processes for the evolution of new activities. Divergence may be gradual, involving simple amino acid residue substitutions, or drastic, such that larger structural elements are inserted, deleted or rearranged. Vast protein sequence comparisons, supported by some experimental evidence, argue that large structural modifications have been necessary for certain catalytic activities to evolve. However, it is not clear whether these activities could not have been attained by gradual changes. Interestingly, catalytic promiscuity could play a fundamental evolutionary role: a preexistent secondary activity could be increased by simple amino acid residue substitutions that do not affect the enzyme's primary activity. The promiscuous profile of the enzyme may be modified gradually by genetic drift, making a pool of potentially useful activities that can be selected before duplication. In this work, we used random mutagenesis and in vivo selection to evolve the Pseudomonas aeruginosa PAO1 carboxylesterase PA3859, a small protein, to attain the function of BioH, a much larger paralog involved in biotin biosynthesis. BioH was chosen as a target activity because it provides a highly sensitive selection for evolved enzymatic activities by auxotrophy complementation. After only two cycles of directed evolution, mutants with the ability to efficiently complement biotin auxotrophy were selected. The in vivo and in vitro characterization showed that the activity of one of our mutant proteins was similar to that of the wild-type BioH enzyme. Our results demonstrate that it is possible to evolve enzymatic activities present in larger proteins by discrete amino acid substitutions.