[PKA活性のin vitro測定のためのキナーゼ-Glo発光キナーゼアッセイ]

目的：in vitroでプロテインキナーゼ（PKA）活性を決定するシンプルで便利で無害な非放射性方法を確立する。 方法：ヒトPKAαCDNAは、RT-PCR法を使用してHEK293細胞の総RNAから増幅され、PGEX-6P-1ベクターにクローン化されました。in vitro精製GST-PKAαタンパク質は、ウエスタンブロット分析によって同定されました。最後に、精製されたGST-PKAαのキナーゼ活性を決定するために、非ラジオアクティブな方法であるキナーゼ-Glo発光キナーゼアッセイが使用されました。 結果：誘導条件の最適化の後、GST-PKAαタンパク質を正常に精製しました。次に、キナーゼ-GLO発光キナーゼアッセイを使用してGST-PKAα活性を決定しました。また、特定のPKA阻害剤であるH-89を使用してGST-PKAαのキナーゼ活性を確認し、そのICを決定しました（50）。値（35.2±3.97）nmol/lは、報告された値と一致しています。 結論：非ラジオアクティブキナーゼ-GLO発光キナーゼアッセイは、PKAのキナーゼ活性を決定する簡単で便利で無害な方法です。この方法は、PKA阻害剤の事前臨床ハイスループットスクリーニング、PKAの新規標的タンパク質を発見し、標的タンパク質のPKAリン酸化部位を調査するのに効果的です。

AIM: To establish a simple, convenient and harmless non-radioactive method of determining protein kinase A (PKA) activity in vitro. METHODS: Human PKAα cDNA was amplified from total RNA of HEK293 cells using RT-PCR method and then cloned into pGEX-6p-1 vector. In vitro purified GST-PKAα protein was identified by Western blot analysis. Finally, a non-radioactive method, Kinase-Glo luminescent kinase assay, was employed to determine the kinase activity of purified GST-PKAα. RESULTS: After the optimization of the induction conditions, we purified GST-PKAα protein successfully. We then determined GST-PKAα activity using Kinase-Glo luminescent kinase assay. We also further confirmed the kinase activity of GST-PKAα using H-89, a specific PKA inhibitor, and determined its IC(50); value (35.2±3.97) nmol/L which is consistent with reported value. CONCLUSION: The non-radioactive Kinase-Glo luminescent kinase assay is a simple, convenient and harmless method of determining the kinase activity of PKA. This method is effective for pre-clinical high-throughput screening of PKA inhibitor, discovering novel target proteins of PKA and investigating PKA phosphorylation sites in target proteins.