トリプシンは、Toll様受容体4アクセサリー分子を介してマクロファージのリポ多糖シグナル伝達を阻害します

目的：マクロファージの免疫応答におけるトリプシンの役割を調べ、プロテアーゼ活性化受容体（PAR）がトリプシンの効果に関与しているかどうかを判断する。 主な方法：C57BL/6野生型マウス、PAR2ノックアウトマウス、およびDDYマウスから分離されたRAW264.7細胞と腹膜マクロファージを使用しました。マクロファージは、トリプシン、トロンビン、およびPARサブタイプ特異的アゴニスト（PARS-AP）の存在下または非存在下で、リポ多糖（LPS）で刺激されました。マクロファージの活性化は、一酸化窒素産生と誘導性一酸化窒素シンターゼ、インターロイキン-1β、インターロイキン-6などの炎症性メディエーターの発現によって定量化されました。LPS受容体に対するトリプシンの効果を明確にするために、Toll様受容体4（TLR4）、可溶性MD-2（SMD-2）、膜結合MD-2（MMD-2）、可溶性CD14の発現も調査しました。SCD14）、および膜結合CD14（MCD14）。CD14タンパク質に対するトリプシンの効果を直接調査するために、組換えCD14タンパク質を発現しました。 重要な発見：トリプシンは、LPS誘発性一酸化窒素産生を阻害し、誘導性一酸化窒素シンターゼ、インターロイキン-1β、およびインターロイキン-6の発現を阻害しました。トリプシンの同じ阻害効果が、野生型マクロファージおよびPAR2ノックアウトマクロファージで観察されました。さらに、他のPARアゴニスト、トロンビン、PAR1-AP、PAR2-AP、およびPAR4-APは、トリプシンの効果を模倣しませんでした。トリプシンはTLR4またはMMD-2発現には影響しませんでしたが、SCD14、MCD14、およびSMD-2発現はトリプシンによって減少しました。さらに、トリプシンは組換えCD14タンパク質も分解しました。 有意性：トリプシンは、TLR4アクセサリー分子の分解により、LPSシグナル伝達を非依存的に阻害しました。この観察は、急性膵炎における複雑な免疫応答をよりよく理解することを提供します。

AIMS: To examine the role of trypsin in the immune response of macrophages and to determine whether protease-activated receptors (PARs) are involved in the effects of trypsin. MAIN METHODS: We used RAW264.7 cells and peritoneal macrophages isolated from C57BL/6 wild-type mice, PAR2 knockout mice, and ddY mice. Macrophages were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) in the presence or absence of trypsin, thrombin, and PAR subtype-specific agonists (PARs-AP). Activation of macrophages was quantified by nitric oxide production and expression of inflammatory mediators, such as inducible nitric oxide synthase, interleukin-1β, and interleukin-6. To clarify the effect of trypsin on LPS receptors, we also investigated the expression of toll-like receptor 4 (TLR4), soluble MD-2 (sMD-2), membrane-bound MD-2 (mMD-2), soluble CD14 (sCD14), and membrane-bound CD14 (mCD14). To directly investigate the effect of trypsin on CD14 protein, we expressed recombinant CD14 protein. KEY FINDINGS: Trypsin inhibited LPS-induced nitric oxide production and expression of inducible nitric oxide synthase, interleukin-1β, and interleukin-6. The same inhibitory effects of trypsin were observed in wild-type macrophages and in PAR2 knockout macrophages. Furthermore, the other PAR agonists, thrombin, PAR1-AP, PAR2-AP, and PAR4-AP, did not mimic the effect of trypsin. Although trypsin did not affect TLR4 or mMD-2 expression, sCD14, mCD14, and sMD-2 expressions were decreased by trypsin. Furthermore, trypsin also degraded recombinant CD14 protein. SIGNIFICANCE: Trypsin inhibited LPS signaling PAR-independently via degradation of TLR4 accessory molecules. This observation provides a better understanding of the complicated immune response in acute pancreatitis.