昆虫細胞におけるヒトUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ発現：活性と不活性の組換えタンパク質の比と、グルクロン酸化速度論に対するC末端Hisタグの効果

多くの研究所は、薬物グルクロン酸研究のために、バキュロウイルス感染昆虫細胞で発現する組換えUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（UGTS）を使用しています。SF9昆虫細胞に、組換えバキュロウイルスの量が増加し、UGT1A9またはUGT2B7のいずれかをコードし、得られた細胞ホモジネートでグルクロン酸化活性と免疫検出可能なUGTの両方を測定しました。グルクロン酸化率と感染症の程度との相関は、活動が測定された実際の活動であるか、UGT発現レベルで修正されたかによって異なる傾向に従いました。特定の低レベルの感染症を超えると、感染比のさらなる増加により、おそらくサンプルに完全なが非アクティブな酵素が存在するため、正常化された活性が大幅に減少しました。免疫検出は活性UGTと非アクティブUGTを区別しないため、組換えUGTの異なるバッチ、特定のUGTの変異体、または異なるUGTの間の正規化された活性の比較は、大きな不正確さになりやすいです。このような不正確さは、UGT発現の慎重な監視と組み合わせて、昆虫細胞の感染症の程度を下げることで減少させることができます。ただし、後者は、準備中のUGT発現レベルを常に利用できるとは限らない抗体を比較するために適切な抗体を必要とします。UGT C末端に融合したPoly-HIS（HIS-TAG）を含むペプチドは、モノクローナル抗体を伴う発現酵素の敏感な免疫検出を可能にします。現在、酵素動態に対する2つのそのような融合ペプチドの効果を慎重に調べました。k（m）値のわずかな増加がHISタグ付きUGTSで検出されていますが、運動モデルやアルブミン添加の影響などのパラメーターには変化はありません。

Many laboratories use recombinant UDP-glucuronosyltransferases (UGTs), expressed in baculovirus-infected insect cells, for drug glucuronidation studies. We have infected Sf9 insect cells with increasing amounts of recombinant baculovirus, encoding either UGT1A9 or UGT2B7, and measured both glucuronidation activity and immunodetectable UGT in the resulting cell homogenates. The correlation between glucuronidation rates and degree of infection followed different trends, depending on whether activity was the actual activity measured or was corrected for UGT expression level. Above a certain low level of infection, further increases in infection ratios led to a large decline in normalized activity, presumably due to the presence of full-length but inactive enzyme in the sample. Because immunodetection does not distinguish between active and inactive UGT, comparison of normalized activity between different batches of a recombinant UGT, mutants of a given UGT, or different UGTs is prone to large inaccuracies. Such inaccuracies could be reduced by lowering the degree of infection of the insect cells, in combination with careful monitoring of UGT expression. However, the latter requires suitable antibodies for comparing UGT expression levels among preparations, antibodies that are not always available. Poly-His (His-tag)-containing peptides, fused to the UGT C terminus, allow sensitive immunodetection of expressed enzymes with monoclonal antibodies. We have now carefully examined the effects of two such fusion peptides on enzyme kinetics. A minor increase in the K(m) values has been detected in the His-tagged UGTs, but no changes in parameters such as the kinetic model and the effects of albumin addition.