ターゲットシーケンスの絶対定量化の改善のためにリアルタイムPCRによって得られた結果の統計分析

背景：リアルタイムの定量的PCRは、臨床研究所でますます使用されています。クローン化された標的配列を含むゲノムDNAまたはプラスミドは、標準曲線のデータを生成するために必要です。これらのデータを分析して、サンプル内のターゲット濃度の相対または絶対量を取得する必要があります。データ分析のために選択された方法は、定量化の結果に強く影響します。特に臨床環境では、絶対定量化が重要です。さまざまな理由で、DNA濃度測定に基づいて目的の遺伝子のコピー数を推定することは曖昧であり、特に細胞株を使用する場合、過大評価に向かう傾向があります。 方法：希釈と複数のチューブアプローチを制限することによって得られたデータは、新しいポアソン分布ベースのソフトウェアを使用して分析され、DNA濃度測定の結果と比較されました。異なる細胞源（末梢血単核細胞と2つの細胞株）からのデータが比較されました。 結果：ポアソン分布によって分析された希釈と複数のチューブアプローチを制限すると、細胞株が使用されている場合、リアルタイムPCRの標準曲線の生成が簡素化され、改善されます。サンプル内の絶対ターゲットコピー数、標準偏差、および95％の信頼区間は、ソフトウェアによって計算されます。 結論：この使いやすいプログラムでは、ターゲットのコピー数を確実に定量化できます。このプログラムは、http：//www.medizin.uni-greifswald.de/innerec/index.php?id=18から無料で入手できます（論文の受け入れ後にリンクがアクティブ化されます）。

BACKGROUND: Real-time quantitative PCR is increasingly used in clinical laboratories. Genomic DNA or plasmids containing cloned target sequences are necessary to generate data for standard curves. These data must be analysed to obtain the relative or absolute quantity of the target concentration in a sample. The method chosen for data analysis can strongly influence results of the quantification. Absolute quantification is important especially in clinical settings. For different reasons estimating the copy number of the gene of interest based on DNA concentration measurements is vague and tends toward overestimation, especially if cell lines are used. METHODS: Data gained by limiting dilution and multiple-tube approach were analyzed using our new Poisson distribution based software and were compared with results from DNA concentration measurement. Data from different cell sources (peripheral blood mononuclear cells and two cell lines) were compared: RESULTS: Limiting dilution and multiple-tube approach analyzed by a Poisson distribution simplifies and improves the generation of standard curves for real time PCR if cell lines are used. The absolute target copy number in a sample, the standard deviation, and a 95% confidence interval are calculated by the software. CONCLUSIONS: With this easy to use program a target copy number can be reliably quantified. The program is available free of charge from: http://www.medizin.uni-greifswald.de/InnereC/index.php?id=18 (link will be activated after acceptance of the paper).