EGCASE Iの調製と特性評価、GSLの包括的な分析に適用され、ロドコッカル発現システムを使用して

エンドグリコセラミダーゼ（EGCASE）は、グリゴ糖（GSL）のオリゴ糖とセラミドの間のβ-グリコシド結合を加水分解できるグリコシダーゼです。特異性が異なる3つの分子種は、ロドコッカスequi（以前のロドコッカスsp。M-750）の培養液で発見され、Egcase I、II、およびIIIに指定されました。この研究では、EGCASE Iの分子クローンと組換え酵素の特性評価について説明します。これは、エリスロポリスを使用したロドコッカル発現システムで高度に発現しました。速度論的分析により、組換えEGCase Iの売上高数（k（cat））（k（cat））は、k（m）であるが、それぞれgm1aおよびgb3cerに向かうegcase IIのそれよりも22倍および1,200倍高いことが明らかになりました。両方の酵素のうち、これらの基質についてはほぼ同じでした。Egcase I（モデル）とEGCase II（結晶）の3次元構造の比較は、EGCase IIではなくEGCase IIの触媒裂け目に柔軟なループが垂れ下がっていることを示しています。変異酵素のうち、ループが触媒領域の基質と産物の代謝回転に影響を与える重要な要因であることを示唆しています。組換えEGCase Iは、EGCase IIと比較して広範な特異性と良好な反応効率を示し、EGCase IをGSLの包括的な分析に適しています。

Endoglycoceramidase (EGCase) is a glycosidase capable of hydrolyzing the β -glycosidic linkage between the oligosaccharides and ceramides of glycosphingolipids (GSLs). Three molecular species of EGCase differing in specificity were found in the culture fluid of Rhodococcus equi (formerly Rhodococcus sp. M-750) and designated EGCase I, II, and III. This study describes the molecular cloning of EGCase I and characterization of the recombinant enzyme, which was highly expressed in a rhodococcal expression system using Rhodococcus erythropolis. Kinetic analysis revealed the turnover number (k(cat)) (k(cat)) of the recombinant EGCase I to be 22- and 1,200-fold higher than that of EGCase II toward GM1a and Gb3Cer, respectively, although the K(m) of both enzymes was almost the same for these substrates. Comparison of the three-dimensional structure of EGCase I (model) and EGCase II (crystal) indicated that a flexible loop hangs over the catalytic cleft of EGCase II but not EGCase I. Deletion of the loop from EGCase II increased the k(cat) of the mutant enzyme, suggesting that the loop is a critical factor affecting the turnover of substrates and products in the catalytic region. Recombinant EGCase I exhibited broad specificity and good reaction efficiency compared with EGCase II, making EGCase I well-suited to a comprehensive analysis of GSLs.