タンパク質標識および単独のビオチン検出のための安定した高親和性ストレプトアビジンモノマー

ストレプトアビジンの第四紀構造、安定性、および機能の間の結合により、バイオテクノロジーアプリケーション向けの安定した高アフィニティモノマーを設計することが困難になります。たとえば、ストレプトアビジンテトラマーの結合ポケットは、単一のドメインタンパク質で複製することはできない複数のサブユニットからの残基で構成されています。しかし、Rhizobium etliのRhizavidinは最近、隣接するサブユニットから寄付された疎水性トリプトファン蓋なしのダイマーとして高い親和性でビオチンを結合することが示されました。特に、Rhizavidinの結合部位は、単一のサブユニットの残基を使用して、結合したビオチンと相互作用します。したがって、ストレプトアビジンモノマーの結合部位残基を対応するリザビジン残基に置き換えると、バイオテクノロジーアプリケーションに役立つ高親和性モノマーの設計につながると仮定しました。ここでは、ストレプトアビジンとリザビジン配列を組み合わせて最適化された生物物理学的特性を実現する構造モノマーMSAの構造と特性評価を報告します。第一に、MSA（K（D）= 2.8 nm）のビオチン親和性は、非拡張的なストレプトアビジンの中で最も高く、ビオチン化リガンドの敏感な一価検出を可能にします。また、モノマーは、他のすべての以前に設計されたモノマーよりも安定性（T（M）= 59.8°C）と溶解度が大幅に高く、その適用中に分子が折りたたまれ、機能的なままであることを保証します。蛍光相関分光法を使用して、MSAがビオチン化標的をモノマーとして結合することを示します。また、分子を遺伝的タグとして使用して、異種タンパク質にビオチン結合能力を導入できることも示しています。たとえば、モノマーを細胞表面受容体に組み合わせて融合することで、ビオチン化フルオロフォアを使用してトランスフェクトされた細胞の直接標識とイメージングが可能になります。MSAなどの安定した機能的ストレプトアビジンモノマーは、単独のビオチン相互作用に基づいた新しい検出システムを設計するための有用な試薬である必要があります。

The coupling between the quaternary structure, stability and function of streptavidin makes it difficult to engineer a stable, high affinity monomer for biotechnology applications. For example, the binding pocket of streptavidin tetramer is comprised of residues from multiple subunits, which cannot be replicated in a single domain protein. However, rhizavidin from Rhizobium etli was recently shown to bind biotin with high affinity as a dimer without the hydrophobic tryptophan lid donated by an adjacent subunit. In particular, the binding site of rhizavidin uses residues from a single subunit to interact with bound biotin. We therefore postulated that replacing the binding site residues of streptavidin monomer with corresponding rhizavidin residues would lead to the design of a high affinity monomer useful for biotechnology applications. Here, we report the construction and characterization of a structural monomer, mSA, which combines the streptavidin and rhizavidin sequences to achieve optimized biophysical properties. First, the biotin affinity of mSA (K(d) = 2.8 nM) is the highest among nontetrameric streptavidin, allowing sensitive monovalent detection of biotinylated ligands. The monomer also has significantly higher stability (T(m) = 59.8 °C) and solubility than all other previously engineered monomers to ensure the molecule remains folded and functional during its application. Using fluorescence correlation spectroscopy, we show that mSA binds biotinylated targets as a monomer. We also show that the molecule can be used as a genetic tag to introduce biotin binding capability to a heterologous protein. For example, recombinantly fusing the monomer to a cell surface receptor allows direct labeling and imaging of transfected cells using biotinylated fluorophores. A stable and functional streptavidin monomer, such as mSA, should be a useful reagent for designing novel detection systems based on monovalent biotin interaction.