新規のアレスチンバイアスデザイナーGタンパク質結合受容体の設計と機能的特性評価

異なるムスカリン受容体サブタイプの変異修飾により、内因性ムスカリン受容体リガンドであるアセチルコリン（ACH）に結合することができないが、クロザピンn-酸化物（CNO）によって効率的に活性化される可能性のある、新規設計者Gタンパク質共役受容体（GPCR）が生成されました。これらのCNO感受性デザイナーGPCR [代替名：デザイナードラッグ（DREADDS）によって独占的に活性化されたデザイナー受容体]は、特定の細胞タイプまたは組織における異なるGタンパク質シグナル伝達経路のin vivoの役割を解剖する強力な新しいツールとして浮上しています。他のGPCRの場合と同様に、CNO活性化DreaddsはヘテロトリメリックGタンパク質にカップルするだけでなく、アレスチンファミリーのタンパク質を補充することもできます（アレスチン-2および-3）。蓄積された証拠は、アレスチンが足場タンパク質として作用して、Gタンパク質非依存性シグナル伝達経路を介したシグナル伝達を促進できることを示唆しています。これらのアレスチン依存性シグナル伝達経路の生理学的関連性を調査するには、アレスチンに偏ったドレッドの入手可能性が非常に望ましいでしょう。この研究では、Gタンパク質に結合することができなくなったが、アレスチンを補充し、アレスチンおよびCNO依存性のファッションでの細胞外シグナル調節キナーゼ-1/2リン酸化を促進することができなくなる、M₃ムスカリン受容体ベースのDREADD [RQ（R165L）]の発達について説明します。さらに、RQ（R165L）構築物を発現するマウスインスリノーマ（MIN6）細胞のCNO治療は、インスリン放出の堅牢なアレスチン依存性刺激をもたらし、インスリン分泌の調節におけるアレスチンシグナル伝達を直接意味します。この新たに開発されたアレスチンに偏ったドレッドは、異なる組織および細胞型におけるアレスチンシグナル伝達経路の生理学的関連性を探るための優れた斬新なツールを表しています。

Mutational modification of distinct muscarinic receptor subtypes has yielded novel designer G protein-coupled receptors (GPCRs) that are unable to bind acetylcholine (ACh), the endogenous muscarinic receptor ligand, but can be efficiently activated by clozapine-N-oxide (CNO), an otherwise pharmacologically inert compound. These CNO-sensitive designer GPCRs [alternative name: designer receptors exclusively activated by designer drug (DREADDs)] have emerged as powerful new tools to dissect the in vivo roles of distinct G protein signaling pathways in specific cell types or tissues. As is the case with other GPCRs, CNO-activated DREADDs not only couple to heterotrimeric G proteins but can also recruit proteins of the arrestin family (arrestin-2 and -3). Accumulating evidence suggests that arrestins can act as scaffolding proteins to promote signaling through G protein-independent signaling pathways. To explore the physiological relevance of these arrestin-dependent signaling pathways, the availability of an arrestin-biased DREADD would be highly desirable. In this study, we describe the development of an M₃ muscarinic receptor-based DREADD [Rq(R165L)] that is no longer able to couple to G proteins but can recruit arrestins and promote extracellular signal-regulated kinase-1/2 phosphorylation in an arrestin- and CNO-dependent fashion. Moreover, CNO treatment of mouse insulinoma (MIN6) cells expressing the Rq(R165L) construct resulted in a robust, arrestin-dependent stimulation of insulin release, directly implicating arrestin signaling in the regulation of insulin secretion. This newly developed arrestin-biased DREADD represents an excellent novel tool to explore the physiological relevance of arrestin signaling pathways in distinct tissues and cell types.