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このユニットでは、RAAV生産のための3プラスミドトランスフェクション方法の詳細な手順について説明し、その利点、制限、トラブルシューティング技術について説明します。さらに、CSCLグラデーションを使用したRAAV精製プロセス、およびSDS-PAGEおよびリアルタイムPCRを使用してベクターの純度、包装効率、ウイルス力価を評価するその後の品質制御方法について説明します。最後に、霊長類組織から新しいAAV CapSIDシーケンスを発見するために使用できるPCRベースの戦略について詳しく説明します。これは、臨床遺伝子療法のためにより多様な組織トロピズムを備えた新しい世代RAAVを開発するために使用できます。
このユニットでは、RAAV生産のための3プラスミドトランスフェクション方法の詳細な手順について説明し、その利点、制限、トラブルシューティング技術について説明します。さらに、CSCLグラデーションを使用したRAAV精製プロセス、およびSDS-PAGEおよびリアルタイムPCRを使用してベクターの純度、包装効率、ウイルス力価を評価するその後の品質制御方法について説明します。最後に、霊長類組織から新しいAAV CapSIDシーケンスを発見するために使用できるPCRベースの戦略について詳しく説明します。これは、臨床遺伝子療法のためにより多様な組織トロピズムを備えた新しい世代RAAVを開発するために使用できます。
In this unit, we describe the detailed procedure for a three-plasmid transfection method for rAAV production, and discuss its advantages, limitations, and troubleshooting techniques. We further discuss the rAAV purification process using CsCl gradients, as well as subsequent quality control methods using SDS-PAGE and real-time PCR to assess vector purity, packaging efficiency, and viral titer. Finally, we elaborate on a PCR-based strategy that can be used to discover novel AAV capsid sequences from primate tissue, which can be used to develop newer-generation rAAVs with a greater diversity of tissue tropism for clinical gene therapy.
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