SNPマーカー分析とそのアプリケーションのための改善された対立遺伝子特異的PCRプライマー設計方法

背景：単一ヌクレオチド多型（SNP）マーカーは位置クローン、関連研究、進化分析のための非常に貴重なツールですが、対立遺伝子特異的PCR（AS-PCR）による低SNP検出効率（AS-PCR）は、他のマーカーのような分子マーカーとしてのアプリケーションを制限しています。単純なシーケンスリピート（SSR）。この問題を克服するために、3'END（SNPサイト）に最も近い3つの塩基内に導入された単一のヌクレオチド人工不一致を備えたプライマーがAS-PCRで使用されています。ただし、1つのSNPサイトでは、3つのベース間で9つの可能な不一致を生成でき、適切なベースを選択してプライマーの特異性を高める方法は依然として課題です。 結果：この研究では、限られた量のプライマーをランダムに使用した以前のレポート（数またはダースペア）とは異なり、2071プライマーペアを使用したプライマー特異性に対するミスマッチ塩基ペア、ミスマッチサイト、SNPタイプの効果を体系的に調査しました。Brassica Oleracea 01-88および02-12のSNPに基づいて設計されました。統計結果によると、（1）我々は、3 '末端から3番目のヌクレオチドのミスマッチ（CA）が最も高い対立遺伝子特異性（81.9％）であるSNP（A/T）で設計されたプライマーが設計されていることを発見しました。。この情報は、大量のSNPサイトからプライマーを設計するときに使用できます。（2）すべてのSNPタイプに唯一の最高のプライマーを形成するプライマー設計原理を実行しました。これは、以前の研究では決して報告されません。さらに、菜種（Brassica Napus L.）とSesame（Sesamum indicum）での可用性をさらに特定しました。設計されたプライマーの高い多型（75％）は、それが一般的な方法であり、他の種に適用できることを示しています。 結論：この研究で提供される方法は、他のAS-PCRプライマー設計方法と比較して、すべてのSNP部位に対してより効果的にプライマーをより効果的に生成できます。SNPプライマーの高い対立遺伝子特異的効率は、低〜中程度のスループットSNP分析の実現可能性を可能にし、作物の遺伝子マッピング、マップベースのクローニング、マーカーアシスト選択に非常に適しています。

BACKGROUND: Although Single Nucleotide Polymorphism (SNP) marker is an invaluable tool for positional cloning, association study and evolutionary analysis, low SNP detection efficiency by Allele-Specific PCR (AS-PCR) still restricts its application as molecular marker like other markers such as Simple Sequence Repeat (SSR). To overcome this problem, primers with a single nucleotide artificial mismatch introduced within the three bases closest to the 3'end (SNP site) have been used in AS-PCR. However, for one SNP site, nine possible mismatches can be generated among the three bases and how to select the right one to increase primer specificity is still a challenge. RESULTS: In this study, different from the previous reports which used a limited quantity of primers randomly (several or dozen pairs), we systematically investigated the effects of mismatch base pairs, mismatch sites and SNP types on primer specificity with 2071 primer pairs, which were designed based on SNPs from Brassica oleracea 01-88 and 02-12. According to the statistical results, we (1) found that the primers designed with SNP (A/T), in which the mismatch (CA) in the 3rd nucleotide from the 3' end, had the highest allele-specificity (81.9%). This information could be used when designing primers from a large quantity of SNP sites; (2) performed the primer design principle which forms the one and only best primer for every SNP type. This is never reported in previous studies. Additionally, we further identified its availability in rapeseed (Brassica napus L.) and sesame (Sesamum indicum). High polymorphism percent (75%) of the designed primers indicated it is a general method and can be applied in other species. CONCLUSION: The method provided in this study can generate primers more effectively for every SNP site compared to other AS-PCR primer design methods. The high allele-specific efficiency of the SNP primer allows the feasibility for low- to moderate- throughput SNP analyses and is much suitable for gene mapping, map-based cloning, and marker-assisted selection in crops.