RPAリン酸化とチェックポイントの活性化におけるDNA-PK、ATM、およびATRの明確な役割。複製ストレスに応じて

DNA複製フォークによって遭遇するDNA損傷は、発がんの前兆であるゲノム不安定化のリスクをもたらします。損傷チェックポイントシステムは、細胞周期の停止を引き起こし、修復を促進し、損傷が深刻な場合にプログラムされた細胞死を誘導します。チェックポイントは、がんを抑制するために作用するDNA損傷応答ネットワークの重要な部分です。DNA損傷と複製機構の摂動は、複製タンパク質A（RPA）に結合した一本鎖DNAの蓄積を特徴とする複製ストレスを引き起こし、これにより、毛細血管拡張症およびRAD3関連（ATR）の活性化とRPA32のリン酸化、RPAのサブユニットのリン酸化を引き起こします。CHK1の活性化と逮捕につながります。DNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（DNA-PKCS）[毛細血圧症（ATM）およびATRに関連するキナーゼ]は、DNA二本鎖切断修復における役割を十分に特徴付けていますが、複製ストレス誘発RPAリン酸化における役割はあまり理解されていません。DNA-PKCS変異細胞はストレス後の複製を阻止できないことを示しており、DNA-PKCが標的とするRPA32リン酸化部位の変異は、有糸分裂の細胞の割合を増加させ、CHK1へのATRシグナル伝達を損ない、G2/M停止欠陥を付与します。ATRおよびDNA-PK（ATMではなく）の阻害は、変異体RPA32を発現する細胞で観察された欠陥を模倣します。変異体RPA32またはDNA-PKCを発現する細胞は、有糸分裂に入る細胞に持続する複製ストレスに応じて持続的なH2AXリン酸化を示し、不適切な有糸分裂侵入を示す。

DNA damage encountered by DNA replication forks poses risks of genome destabilization, a precursor to carcinogenesis. Damage checkpoint systems cause cell cycle arrest, promote repair and induce programed cell death when damage is severe. Checkpoints are critical parts of the DNA damage response network that act to suppress cancer. DNA damage and perturbation of replication machinery causes replication stress, characterized by accumulation of single-stranded DNA bound by replication protein A (RPA), which triggers activation of ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) and phosphorylation of the RPA32, subunit of RPA, leading to Chk1 activation and arrest. DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) [a kinase related to ataxia telangiectasia mutated (ATM) and ATR] has well characterized roles in DNA double-strand break repair, but poorly understood roles in replication stress-induced RPA phosphorylation. We show that DNA-PKcs mutant cells fail to arrest replication following stress, and mutations in RPA32 phosphorylation sites targeted by DNA-PKcs increase the proportion of cells in mitosis, impair ATR signaling to Chk1 and confer a G2/M arrest defect. Inhibition of ATR and DNA-PK (but not ATM), mimic the defects observed in cells expressing mutant RPA32. Cells expressing mutant RPA32 or DNA-PKcs show sustained H2AX phosphorylation in response to replication stress that persists in cells entering mitosis, indicating inappropriate mitotic entry with unrepaired damage.