部分アクセプターフォトブリーチングベースの定量的FRETメソッドは、排出スペクトルクロストークを完全に克服する

最近報告したPBFRETという名前の定量的蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）メソッドに基づいて、B-PBFRETメソッドという名前の部分アクセプター光退色ベースの定量的FRETアルゴリズムを開発しました。B-PBFRETは、アクセプター励起クロストークおよびドナー排出スペクトルクロストークだけでなく、蛍光寿命（FLIM）、アクセプターフォトブリーシング後のドナーの蛍光回収、および受容体感受性放出（SE）を含む蛍光寿命（FLIM）、ドナーの蛍光回復（SE）を含む以前の方法に嫌がらせをするアクセプター排出スペクトルクロストークを克服します。方法。B-PBFRETメソッドは、部分的なアクセプター光退色の前後にドナー励起でドナーとアクセプターチャネルの両方の蛍光強度を同時に測定することにより実装され、検証済みの参照なしでFRET効率（e）を直接測定できます。B-PBFRETの理論分析に基づいて、特定のドナーacceptorペアに対してPBFRETによって測定された値から絶対Eを取得するために、C-PBFRETという名前のより単純な修正方法も開発しました。単一の生細胞で、2つのリンクされたコンストラクト、18AAおよびSCAT3タンパク質のEを測定することにより、B-PBFRETメソッドとC-PBFRETメソッドの両方を検証し、我々のデータは、B-PBFRETおよびC-PBFRET法の両方が絶対Eを直接測定できることを実証しました。さまざまな程度のアクセプター排出スペクトルクロストークで生細胞内のリンクされたコンストラクトのうち。

Based on the quantitative fluorescence resonance energy transfer (FRET) method named PbFRET we reported recently, we herein developed a partial acceptor photobleaching-based quantitative FRET algorithm named B-PbFRET method. B-PbFRET overcomes not only the acceptor excitation crosstalk and donor emission spectral crosstalk but also the acceptor emission spectral crosstalk that harasses previous methods including fluorescence lifetime (FLIM), fluorescence recovery of donor after acceptor photobleaching, and acceptor sensitized emission (SE)-based methods. B-PbFRET method is implemented by simultaneously measuring the fluorescence intensity of both donor and acceptor channels at donor excitation before and after partial acceptor photobleaching, and it can directly measure the FRET efficiency (E) without any verified references. Based on the theoretical analysis of B-PbFRET, we also developed a more straightforward correction method named C-PbFRET to obtain the absolute E from the value measured by PbFRET for a given donor-acceptor pair. We validated both B-PbFRET and C-PbFRET methods by measuring the E of two linked constructs, 18AA and SCAT3 proteins, in single living cells, and our data demonstrated that both B-PbFRET and C-PbFRET methods can directly measure the absolute E of the linked constructs inside living cells under different degrees of acceptor emission spectral crosstalk.