TALエフェクターでGをターゲットにする：NNおよびNKを繰り返して構築されたタレンの活動の比較可変Di-耐性

転写活性化因子様（TAL）エフェクターのDNA結合ドメインを簡単に設計して、新しいDNA配列特異性を持つことができます。その結果、エンジニアリングされたTALエフェクタータンパク質は、in vivoでゲノムを操作するための重要な試薬になりました。TALエフェクターによるDNA結合は、34アミノ酸リピートのアレイによって媒介されます。各繰り返しでは、2つのアミノ酸のうち1つ（繰り返し可変Di-residues、RVD）がDNA標的のベースに接触します。C、T、およびAの特異性を持つRVDが記載されています。ただし、GをターゲットにするRVDの中で、RVD NNもAに結合し、NKは自然に発生するTALエフェクターではまれです。ここでは、Gを指定するためにNKで作られたTALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）がNNを含む対応物よりも少ない活性を示していることを示しています。NNで作られた15の15のTalenペアのうち14がNKと作られた同一の張りよりも多くの活性を示しました。これらのTalenペアのうち3つのヒト細胞で活動がアッセイされ、結果は酵母データと並行していました。in vivoデータは、NK含有TALエフェクターがNNを含む対応物よりもGのターゲットに対する親和性が低いことを示す結合親和性のin vitro測定によって説明されます。GがAに置き換えられたターゲットでは、NK含有タレンに対してより高いg特異性が観察されました。さまざまなNおよびC末端切り捨ての張りは、2つのTalen結合部位間のスペーサーの長さが異なるターゲットでもテストされました。繰り返し配列が14〜33 bpの広範なスペーサーの長さにわたってターゲットを切断した後、63または231アミノ酸のC末端を持つたりません。ただし、繰り返し配列の後にわずか18 AAのタレンは、13〜16 bpのスペーサーに明確な最適を示しました。ここに示されているデータは、技術的なTALエフェクタータンパク質の特異性と活性を向上させるための有用なガイドラインを提供します。

The DNA binding domain of Transcription Activator-Like (TAL) effectors can easily be engineered to have new DNA sequence specificities. Consequently, engineered TAL effector proteins have become important reagents for manipulating genomes in vivo. DNA binding by TAL effectors is mediated by arrays of 34 amino acid repeats. In each repeat, one of two amino acids (repeat variable di-residues, RVDs) contacts a base in the DNA target. RVDs with specificity for C, T and A have been described; however, among RVDs that target G, the RVD NN also binds A, and NK is rare among naturally occurring TAL effectors. Here we show that TAL effector nucleases (TALENs) made with NK to specify G have less activity than their NN-containing counterparts: fourteen of fifteen TALEN pairs made with NN showed more activity in a yeast recombination assay than otherwise identical TALENs made with NK. Activity was assayed for three of these TALEN pairs in human cells, and the results paralleled the yeast data. The in vivo data is explained by in vitro measurements of binding affinity demonstrating that NK-containing TAL effectors have less affinity for targets with G than their NN-containing counterparts. On targets for which G was substituted with A, higher G-specificity was observed for NK-containing TALENs. TALENs with different N- and C-terminal truncations were also tested on targets that differed in the length of the spacer between the two TALEN binding sites. TALENs with C-termini of either 63 or 231 amino acids after the repeat array cleaved targets across a broad range of spacer lengths - from 14 to 33 bp. TALENs with only 18 aa after the repeat array, however, showed a clear optimum for spacers of 13 to 16 bp. The data presented here provide useful guidelines for increasing the specificity and activity of engineered TAL effector proteins.