イオントレントPGMベンチトップシーケンサーのインデル検出特異性の向上

ベンチトップシーケンサーの出現により、次世代シーケンスを使用して臨床遺伝子検査が実現可能になりました。ION Torrent's PGM™は、単一のヌクレオチド変動（SNV）およびマイクロインデル変動（インデル）の検出における臨床的約束を示すこのようなベンチトップシーケンサーの1つです。しかし、ホモポリマーシーケンスエラーの高頻度によって引き起こされる多数の偽陽性インデルは、臨床遺伝子検査のためのPGM™の使用を妨げています。シーケンスからのPGM™データの広範な分析は、6つの生殖細胞系サンプルからのBRCA1およびBRCA2遺伝子のEscherichia coli DH10B株のよく特徴づけられたゲノムの読み取りとシーケンスを実施しました。3つの一般的に使用されるバリアント検出ツール、Samtools、Dindel、およびGatkの統合ジェノタイパーはすべて、インデルに対して実質的な偽陽性率を持っていました。2つの主要な測定にフィルターを組み込むことにより、感度を犠牲にすることなく、偽陽性率を劇的に改善することができます。2つの測定値は、インデル位置あたりのギャップとインサート（VARW）の幅のb-アレル周波数（BAF）と変動でした。UnifiedGenotyperによって検出されたインデルに適用されたBAFしきい値は、DH10BとBRCAシーケンスの両方で検出されたインデルエラーの99％を除去しました。BRCAシーケンスの最適なBAFしきい値は、参照としてサンガーシーケンスから検出されたバリアントを使用して、100％の検出感度と最小誤検出率を必要とすることにより決定されました。これにより、15のインデルエラーが残り、そのうち7つのインデルエラーがゼロのvarwしきい値を選択して削除されました。VARW固有のエラーは、BRCAデータセットの読み取り深度が高いほど周波数が増加し、カバレッジの深さを増やすことでホモポリマー関連のインデルエラーを減らすことができないことを示唆しています。したがって、VARWのしきい値を使用することは、より高いカバレッジでデータからのインデルエラーを減らすために重要である可能性があります。結論として、BAFおよびVARWのしきい値は、感度を損なうことなくPGM™データのインデル検出の特異性を改善できるシンプルで効果的なフィルタリング基準を提供します。

The emergence of benchtop sequencers has made clinical genetic testing using next-generation sequencing more feasible. Ion Torrent's PGM™ is one such benchtop sequencer that shows clinical promise in detecting single nucleotide variations (SNVs) and microindel variations (indels). However, the large number of false positive indels caused by the high frequency of homopolymer sequencing errors has impeded PGM™'s usage for clinical genetic testing. An extensive analysis of PGM™ data from the sequencing reads of the well-characterized genome of the Escherichia coli DH10B strain and sequences of the BRCA1 and BRCA2 genes from six germline samples was done. Three commonly used variant detection tools, SAMtools, Dindel, and GATK's Unified Genotyper, all had substantial false positive rates for indels. By incorporating filters on two major measures we could dramatically improve false positive rates without sacrificing sensitivity. The two measures were: B-Allele Frequency (BAF) and VARiation of the Width of gaps and inserts (VARW) per indel position. A BAF threshold applied to indels detected by UnifiedGenotyper removed ~99% of the indel errors detected in both the DH10B and BRCA sequences. The optimum BAF threshold for BRCA sequences was determined by requiring 100% detection sensitivity and minimum false discovery rate, using variants detected from Sanger sequencing as reference. This resulted in 15 indel errors remaining, of which 7 indel errors were removed by selecting a VARW threshold of zero. VARW specific errors increased in frequency with higher read depth in the BRCA datasets, suggesting that homopolymer-associated indel errors cannot be reduced by increasing the depth of coverage. Thus, using a VARW threshold is likely to be important in reducing indel errors from data with higher coverage. In conclusion, BAF and VARW thresholds provide simple and effective filtering criteria that can improve the specificity of indel detection in PGM™ data without compromising sensitivity.