新規赤方偏移ミトコンドリア標的cameleonを使用したサイトゾルとミトコンドリアCa（2+）シグナルの間の時空間的相関

サイトゾルからミトコンドリアの内腔へのCa（2+）の移動は、細胞シグナル伝達に複数の方法で影響を与える重要なプロセスです。サイトゾルCa（2+）（[Ca（2+）]（CyTO））は、レシオメトリックCa（2+）プローブFURA-2で非常に定量化できますが、遺伝的にエンコードされたFörster共鳴エネルギー移動（FRET）ベースの蛍光Ca（2+）センサーであるキャメンロンは、オルガネラ内のCa（2+）を特異的に測定するために効率的に使用されます。ただし、ほとんどの既存のラクアロンのシアンおよび黄色の蛍光タンパク質のスペクトルとFura-2発光と有意な重複のために、1つの細胞内のFura-2およびCameleonの測定は複雑なタスクです。この研究では、単一の細胞レベルで[Ca（2+）]（CyTO）およびミトコンドリアCa（2+）（[Ca（2+）]）シグナルを同時に評価するための新しいアプローチを導入します。スペクトルオーバーラップを排除するために、緑とオレンジの蛍光タンパク質をFRETペアとして使用した新しい赤方偏移カメレオンD1GO-CAMを開発しました。この比率Ca（2+）プローブは、ミトコンドリアの標的を正常に標的とする可能性があり、[Ca（2+）]（CyTO）および[Ca（2+）]（MITO）を同じ内で相関させるためにFURA-2と同時に使用するのに適していました。個々のセル。私たちのデータは、[ca（2+）]（cyto）上昇の速度論によって、[ca（2+）]（cyto）と[ca（2+）]（mito）信号の開始の間に有意な遅れがあることを示しています。、ミトコンドリアCa（2+）の取り込みを活性化するために必要な[ca（2+）]（cyto）の特定のしきい値を指します。[Ca（2+）]（Mito）と[Ca（2+）]（CyTO）の間の時間的相関と、Ca（2+）の細胞質ゾルからミトコンドリアへの移動の効率は、異なる細胞間で変化します。さらに、ゆっくりとミトコンドリアCa（2+）押出とミトコンドリアCa（2+）の取り込みの脱感作は、D-グルコースに応じて膵臓ベータ細胞のミトコンドリアおよび細胞質Ca（2+）振動のパターンに明確な違いをもたらします。

The transfer of Ca(2+) from the cytosol into the lumen of mitochondria is a crucial process that impacts cell signaling in multiple ways. Cytosolic Ca(2+) ([Ca(2+)](cyto)) can be excellently quantified with the ratiometric Ca(2+) probe fura-2, while genetically encoded Förster resonance energy transfer (FRET)-based fluorescent Ca(2+) sensors, the cameleons, are efficiently used to specifically measure Ca(2+) within organelles. However, because of a significant overlap of the fura-2 emission with the spectra of the cyan and yellow fluorescent protein of most of the existing cameleons, the measurement of fura-2 and cameleons within one given cell is a complex task. In this study, we introduce a novel approach to simultaneously assess [Ca(2+)](cyto) and mitochondrial Ca(2+) ([Ca(2+)](mito)) signals at the single cell level. In order to eliminate the spectral overlap we developed a novel red-shifted cameleon, D1GO-Cam, in which the green and orange fluorescent proteins were used as the FRET pair. This ratiometric Ca(2+) probe could be successfully targeted to mitochondria and was suitable to be used simultaneously with fura-2 to correlate [Ca(2+)](cyto) and [Ca(2+)](mito) within same individual cells. Our data indicate that depending on the kinetics of [Ca(2+)](cyto) rises there is a significant lag between onset of [Ca(2+)](cyto) and [Ca(2+)](mito) signals, pointing to a certain threshold of [Ca(2+)](cyto) necessary to activate mitochondrial Ca(2+) uptake. The temporal correlation between [Ca(2+)](mito) and [Ca(2+)](cyto) as well as the efficiency of the transfer of Ca(2+) from the cytosol into mitochondria varies between different cell types. Moreover, slow mitochondrial Ca(2+) extrusion and a desensitization of mitochondrial Ca(2+) uptake cause a clear difference in patterns of mitochondrial and cytosolic Ca(2+) oscillations of pancreatic beta-cells in response to D-glucose.