定量的リアルタイムPCRを使用したウイルス感染ニコチアナベンサミアナにおける遺伝子発現研究のための参照遺伝子の検証

Nicotiana Benthamianaは、植物ウイルス学で最も広く使用されている実験宿主です。N. Benthamianaのドラフトゲノム配列の最近のリリースは、植物病原体相互作用のモデルとしての役割を統合しています。定量的リアルタイムPCR（QPCR）は、定量的遺伝子発現分析に一般的に採用されています。有効なQPCR分析には、適切な内部制御に対する遺伝子発現の正確な正規化が必要です。しかし、ウイルス感染症の条件下で、N。benthamianaの参照遺伝子の安定性に関する体系的な調査はほとんどありませんでした。この研究では、16の一般的に使用されるハウスキーピング遺伝子の発現プロファイル（GAPDH、18S、EF1α、SAMD、L23、UK、PP2A、APR、UBI3、SAND、ACT、TUB、GBP、F-Box、PPRおよびTIP41）の発現が決定されました。N. Benthamianaでは、5つのRNA植物ウイルスの1つに感染したN. Benthamiana Leaf組織から調製された相補性DNAのQPCRによる転写安定性分析のために、許容可能な発現レベルを持つ人々はさらに選択されました（タバコ壊死ウイルスA、ビートブラックスコーヒウイルス、ビート壊死性黄色の静脈ウイルス、大麦ストライプモザイクウイルス、ジャガイモウイルスx）。遺伝子の安定性は、Genorm、Normfinder、およびBestKeeperの3つの一般的に使用されている専用アルゴリズムによって並行して分析されました。統計分析により、PP2A、F-box、およびL23遺伝子が全体的に最も安定したものであり、これら3つの遺伝子の組み合わせが正確な正常化に十分であることが明らかになりました。さらに、参照遺伝子としてのPP2A、F-box、およびL23の適合性は、ウイルスに感染したN. Benthamianaの葉におけるAgo2およびRDR6の発現レベル分析によって示されました。これは、N。benthamianaの異なる参照遺伝子の安定性を体系的に調べて評価する最初の研究です。我々の結果は、これらのウイルスを研究している研究者が、QPCR実験のノーマイザーとして使用する潜在的なハウスキーピング遺伝子の最終リストを提供するだけでなく、他の生物的および非生物的ストレス条件下でのN.ベンサミアナの遺伝子発現研究のための適切な参照遺伝子の選択を導くべきです。

Nicotiana benthamiana is the most widely-used experimental host in plant virology. The recent release of the draft genome sequence for N. benthamiana consolidates its role as a model for plant-pathogen interactions. Quantitative real-time PCR (qPCR) is commonly employed for quantitative gene expression analysis. For valid qPCR analysis, accurate normalisation of gene expression against an appropriate internal control is required. Yet there has been little systematic investigation of reference gene stability in N. benthamiana under conditions of viral infections. In this study, the expression profiles of 16 commonly used housekeeping genes (GAPDH, 18S, EF1α, SAMD, L23, UK, PP2A, APR, UBI3, SAND, ACT, TUB, GBP, F-BOX, PPR and TIP41) were determined in N. benthamiana and those with acceptable expression levels were further selected for transcript stability analysis by qPCR of complementary DNA prepared from N. benthamiana leaf tissue infected with one of five RNA plant viruses (Tobacco necrosis virus A, Beet black scorch virus, Beet necrotic yellow vein virus, Barley stripe mosaic virus and Potato virus X). Gene stability was analysed in parallel by three commonly-used dedicated algorithms: geNorm, NormFinder and BestKeeper. Statistical analysis revealed that the PP2A, F-BOX and L23 genes were the most stable overall, and that the combination of these three genes was sufficient for accurate normalisation. In addition, the suitability of PP2A, F-BOX and L23 as reference genes was illustrated by expression-level analysis of AGO2 and RdR6 in virus-infected N. benthamiana leaves. This is the first study to systematically examine and evaluate the stability of different reference genes in N. benthamiana. Our results not only provide researchers studying these viruses a shortlist of potential housekeeping genes to use as normalisers for qPCR experiments, but should also guide the selection of appropriate reference genes for gene expression studies of N. benthamiana under other biotic and abiotic stress conditions.