ヒト多能性幹細胞からの心筋細胞の生成のための新規2次元指向分化システムの開発

背景：ヒト多能性幹細胞（HPSC）は、虚血性心疾患の治療に大きな期待を抱いています。ただし、HPSCを区別するための現在のプロトコルは、低収量をもたらすか、高価なサイトカインを必要とします。 方法：ここでは、特別なサイトカインを使用せずにHPSCから高収量の心筋細胞（CMS）を生成する新しい2次元（2D）段階的分化システムを開発しました。当初、未分化のHPSCは、胚性体（EBS）を数日間形成せずにマトリゲルコーティングプレートに移し、BFGF枯渇ヒト胚性幹細胞（HESC）培地で培養しました。HPSCコロニーの縁に線形細胞凝集が現れると、培地は10％胎児ウシ血清（FBS）を添加したDMEMに変更しました。その後、セルクラスターが見えるようになったとき、培地は20％FBSでDMEMに変更されました。 結果と結論：約2週間の培養で、契約クラスターが現れ始め、契約クラスターの数が継続的に増加し、すべてのクラスターの約70％に達しました。これらのクラスターは、単層CMSに対する2段階の酵素治療によって解離され、そのうち約90％がα-ミオシン重鎖レポーターシステムによって確認されたCM表現型を示しました。電気生理学的研究では、HPSC由来のCMSが3つの主要なCM活動電位タイプを示し、61〜78％が心室CM表現型を持っていることが示されました。この分化システムは、中胚葉細胞クラスターのCMSへの分化のための周囲の内胚葉細胞の明確な時空の役割を示しました。結論として、このシステムは、サイトカインを使用せずにHPSCからCMSを高収量で生成し、HPSCの開発をCMSに研究するための新しいプラットフォームを提供します。

BACKGROUND: Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for treating ischemic heart disease. However, current protocols for differentiating hPSCs either result in low yields or require expensive cytokines. METHODS: Here we developed a novel two dimensional (2D) stepwise differentiation system that generates a high yield of cardiomyocytes (CMs) from hPSCs without using special cytokines. Initially, undifferentiated hPSCs were transferred onto Matrigel-coated plates without forming embryoid bodies (EBs) for a few days and were cultured in bFGF-depleted human embryonic stem cells (hESCs) medium. When linear cell aggregation appeared in the margins of the hPSC colonies, the medium was changed to DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Thereafter when cell clusters became visible, the medium was changed to DMEM with 20% FBS. RESULTS AND CONCLUSIONS: At about two weeks of culture, contracting clusters began to appear and the number of contracting clusters continuously increased, reaching approximately 70% of all clusters. These clusters were dissociated by two-step enzyme treatment to monolayered CMs, of which ~90% showed CM phenotypes confirmed by an α-myosin heavy chain reporter system. Electrophysiologic studies demonstrated that the hPSC-derived CMs showed three major CM action potential types with 61 to 78% having a ventricular-CM phenotype. This differentiation system showed a clear spatiotemporal role of the surrounding endodermal cells for differentiation of mesodermal cell clusters into CMs. In conclusion, this system provides a novel platform to generate CMs from hPSCs at high yield without using cytokines and to study the development of hPSCs into CMs.