無傷の細胞マトリックス支援レーザー脱着/イオン化質量分析タイピングによるバークホルドリアマレイとバークホルデリアpseudomalleiの迅速な同定

背景：Burkholderia（B。）PseudomalleiおよびB. Malleiは、遺伝的に密接に関連する種です。B.偽類は人間と動物に様子症を引き起こしますが、B。malleiは馬の腺の原因剤であり、人間でもめったにありません。両方のエージェントは、CDCによって優先カテゴリB生物学的薬剤として分類されています。両方の薬剤が多くの抗生物質に対して本質的に耐性があるため、迅速な識別が重要です。マトリックス支援レーザー脱着/イオン化質量分析（MALDI-TOF MS）は、病原体の迅速かつ信頼できる識別の可能性がありますが、検証済みの参照スペクトルを含むデータベースの利用可能性によって制限されています。この研究の目的は、B。pseudomalleiとB. Malleiの迅速かつ信頼できる識別と区別にMaldi-ToF MSの使用を評価し、両方の生物の信頼できる参照データベースを構築することでした。 結果：10のB. pseudomalleiと17のB. Mallei株のコレクションを使用して、参照スペクトルのライブラリを生成しました。参照スペクトルライブラリの専用サブセットが使用された場合、両方の種のサンプルはMALDI-TOF MSによって識別される可能性があります。B. malleiを表すサンプルと比較して、B。pseudomalleiの間のより高い遺伝的多様性は、質量スペクトルと微生物の識別のために市販のソフトウェアで得られたより広範な識別スコア値の間のより高い平均ユークレディアン距離に反映されました。B. pseudomallei（ATCC 23343）の型株は数十年前に分離され、おそらくこの株のスペクトルに特にかつ再現性がある14 DAの2つの集中的な一連の質量増分によって示されるように、おそらく大量のメチル化により、スペクトルベースの樹状図で顕著です。 結論：BSL 3条件下での病原体の取り扱いは危険で扱いにくいですが、エタノールによる細菌の不活性化、BSL 1条件下でのその後のタンパク質抽出、およびMALDI-TOF MS分析は核形成法よりも速くなることで最小限に抑えることができます。私たちのスペクトルは、B。pseudomallei分離株よりもB. Malleiの均一性が高いことを示しました。密接に関連する種について予想されるように、Maldi Biotyperソフトウェア（Bruker Daltonik GmbH、ブレーメン、ドイツ）との識別プロセスには、参照株からのスペクトルを慎重に選択する必要があります。専用の参照セットが使用され、高品質のスペクトルが取得されると、両方の種を明確に区別することができます。参照スペクトルデータベースの慎重なキュレーションの必要性が強調されています。

BACKGROUND: Burkholderia (B.) pseudomallei and B. mallei are genetically closely related species. B. pseudomallei causes melioidosis in humans and animals, whereas B. mallei is the causative agent of glanders in equines and rarely also in humans. Both agents have been classified by the CDC as priority category B biological agents. Rapid identification is crucial, because both agents are intrinsically resistant to many antibiotics. Matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has the potential of rapid and reliable identification of pathogens, but is limited by the availability of a database containing validated reference spectra. The aim of this study was to evaluate the use of MALDI-TOF MS for the rapid and reliable identification and differentiation of B. pseudomallei and B. mallei and to build up a reliable reference database for both organisms. RESULTS: A collection of ten B. pseudomallei and seventeen B. mallei strains was used to generate a library of reference spectra. Samples of both species could be identified by MALDI-TOF MS, if a dedicated subset of the reference spectra library was used. In comparison with samples representing B. mallei, higher genetic diversity among B. pseudomallei was reflected in the higher average Eucledian distances between the mass spectra and a broader range of identification score values obtained with commercial software for the identification of microorganisms. The type strain of B. pseudomallei (ATCC 23343) was isolated decades ago and is outstanding in the spectrum-based dendrograms probably due to massive methylations as indicated by two intensive series of mass increments of 14 Da specifically and reproducibly found in the spectra of this strain. CONCLUSIONS: Handling of pathogens under BSL 3 conditions is dangerous and cumbersome but can be minimized by inactivation of bacteria with ethanol, subsequent protein extraction under BSL 1 conditions and MALDI-TOF MS analysis being faster than nucleic amplification methods. Our spectra demonstrated a higher homogeneity in B. mallei than in B. pseudomallei isolates. As expected for closely related species, the identification process with MALDI Biotyper software (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) requires the careful selection of spectra from reference strains. When a dedicated reference set is used and spectra of high quality are acquired, it is possible to distinguish both species unambiguously. The need for a careful curation of reference spectra databases is stressed.