流出転写によって調製された化学的にアミノアシル化された転写RNAによるアンバー変異のin vitro抑制

AmberサプレッサーTRNAは、T7 RNAポリメラーゼによる流出転写によりin vitroで調製されました。Acceptor Stemから3 '末端PCPAを欠く完全なTRNAと切り捨てられたtRNAの両方は、同じDNAテンプレートから合成できます。切り捨てられた流出サプレッサーTRNAは、フェニルアラニル-PCPAに酵素的に連結して、アミノアシル化された全長サプレッサーTRNA（PHE-TRNA（CUA））を生成することができます。PHE-TRNA（CUA）は、天然分離されたtRNAのアンチコドンループ置換によって調製されたサプレッサーとして等価効率でin vitroでAmber（UAG）変異を抑制することができます。アンチコドンループ置換と比較して、この方法を使用したサプレッサーTRNA調製の容易さは、不自然なアミノ酸をタンパク質に特別に組み込むための化学的にアシル化された抑制tRNAの使用を大幅に促進します。

An amber suppressor tRNA was prepared in vitro by runoff transcription with T7 RNA polymerase. Both full-length tRNA and truncated tRNA lacking the 3' terminal pCpA from the acceptor stem could be synthesized from the same DNA template. Truncated runoff suppressor tRNA could be enzymatically ligated to phenylalanyl-pCpA to generate aminoacylated full-length suppressor tRNA (Phe-tRNA(CUA)). Phe-tRNA(CUA) is capable of suppressing an amber (UAG) mutation in vitro with equivalent efficiency as suppressor prepared by anticodon-loop replacement of a naturally-isolated tRNA. The ease of suppressor tRNA preparation using this method, compared to anticodon-loop replacement, greatly facilitates the use of chemically acylated suppressor tRNA's for site-specifically incorporating unnatural amino acids into proteins.