SSBコーティングされたssDNAの単一分子での再生と成長の直接イメージング

Escherichia coli Recaは、分解DNAを修復することによりゲノム完全性を維持する経路である相同組換えに不可欠なDNA鎖交換タンパク質のユビキタスなクラスの定義メンバーです。機能するために、RECAのフィラメントは、SSDNA結合タンパク質（SSB）と直接競合する一本鎖DNA（SSDNA）で核形成し、成長しなければなりません。別のタンパク質と競合するDNA格子のこの動的自己組織化は、アクチンやチューブリンなどの他のフィラメント形成タンパク質と比較してRECAファミリーにとってユニークです。このプロセスの複雑さは、広範で多様な試みにもかかわらず、アンサンブル測定は核生成段階と成長段階を確実に区別できないため、Recaフィラメントアセンブリの理解を妨げています。以前の単一分子アッセイでは、裸の二本鎖DNAおよびssDNAにおけるRecaおよびその真核生物ホモログRad51の核形成と成長を測定しました。ただし、in vivoでのRECA自己組織化のテンプレートはSSBコーティングSSDNAです。単一分子顕微鏡を使用して、ここでは、SSBでコーティングされたSSDNAの単一分子のRecAフィラメントアセンブリを直接視覚化し、同時に核生成と成長を測定します。核生成にはRECAの二量体が必要であり、その後、モノマーの添加によるフィラメントの成長が続くことを確立します。これは、核形成ではなく成長がヌクレオチドおよびマグネシウムイオン補因子によって調節されるという発見と一致しています。フィラメントの成長は、5 '→3'方向ではより速くはありますが、双方向です。生理学的状態では核生成と成長の両方が抑制されており、in vivoでの組み立てにおける組換えメディエーターの本質的な役割を強調しています。SSBスライドおよび/または部分的な解離（DNAアンラッピング）中に一時的に露出したssDNAでRecaが核化する2段階の運動メカニズムを定義し、その後Recaフィラメントが成長します。さらに、再結合メディエータータンパク質ペアであるレコール（RECOおよびRICL）が、復活とフィラメントの成長の両方を加速し、RECFの導入が再生核生成をさらに刺激することを実証します。

Escherichia coli RecA is the defining member of a ubiquitous class of DNA strand-exchange proteins that are essential for homologous recombination, a pathway that maintains genomic integrity by repairing broken DNA. To function, filaments of RecA must nucleate and grow on single-stranded DNA (ssDNA) in direct competition with ssDNA-binding protein (SSB), which rapidly binds and continuously sequesters ssDNA, kinetically blocking RecA assembly. This dynamic self-assembly on a DNA lattice, in competition with another protein, is unique for the RecA family compared to other filament-forming proteins such as actin and tubulin. The complexity of this process has hindered our understanding of RecA filament assembly because ensemble measurements cannot reliably distinguish between the nucleation and growth phases, despite extensive and diverse attempts. Previous single-molecule assays have measured the nucleation and growth of RecA--and its eukaryotic homologue RAD51--on naked double-stranded DNA and ssDNA; however, the template for RecA self-assembly in vivo is SSB-coated ssDNA. Using single-molecule microscopy, here we directly visualize RecA filament assembly on single molecules of SSB-coated ssDNA, simultaneously measuring nucleation and growth. We establish that a dimer of RecA is required for nucleation, followed by growth of the filament through monomer addition, consistent with the finding that nucleation, but not growth, is modulated by nucleotide and magnesium ion cofactors. Filament growth is bidirectional, albeit faster in the 5'→3' direction. Both nucleation and growth are repressed at physiological conditions, highlighting the essential role of recombination mediators in potentiating assembly in vivo. We define a two-step kinetic mechanism in which RecA nucleates on transiently exposed ssDNA during SSB sliding and/or partial dissociation (DNA unwrapping) and then the RecA filament grows. We further demonstrate that the recombination mediator protein pair, RecOR (RecO and RecR), accelerates both RecA nucleation and filament growth, and that the introduction of RecF further stimulates RecA nucleation.