AMPK/AKT/MTORシグナル伝達とオートファジーの調整された時間依存的変調は、ヒト間葉系幹細胞の骨形成分化を制御します

AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）、AKT、ラパマイシン（MTOR）の哺乳類標的、オートファジー、およびヒト歯髄間葉系幹細胞の骨形成分化におけるそれらの相互作用の役割を調査しました。AMPK、AKT、およびMTORシグナル伝達経路とオートファジーのさまざまなメンバーの活性化は、免疫ブロットによって分析されましたが、骨形成分化は、アルカリ性ホスファターゼ染色とリアルタイムRT-PCR/免疫ブロットの誤った転写因子2およびBoneの免疫ブロット定量化によって評価されました。形態形成タンパク質2 mRNAおよび/またはタンパク質レベル。間葉系幹細胞の骨形成分化は、AMPKとその標的ラプターの初期（1日目）活性化と関連しており、MTORとその基質P70S6キナーゼの阻害と一致しました。オートファジーの初期の誘導は、オートファゴソーム結合LC3-IIの蓄積、プロオートファジーベクリン-1のアップレギュレーション、および選択的オートファジー標的P62の減少によって実証されました。これに続いて、分化の3〜7日目にAkt/mTORの後期活性化が行われました。AMPK、MTORまたはオートファジーに必須のLC3βのRNA干渉媒介サイレンシング、ならびにAMPK（化合物C）、AKT（10-DEBC塩酸）、MTOR（ラパマイシン）、オートファジー（バフィロミシンA1、クロロキンおよびアムモニウムとアムモンキンとアムモニウムの薬理学的阻害剤」塩化物）、それぞれが骨芽細胞への間葉系幹細胞分化を抑制しました。AMPKノックダウンは、早期のmTOR阻害とオートファジー誘導、およびAKT/mTORシグナル伝達の遅延活性化を防止し、AKT阻害はAMPKリン酸化に影響を与えることなくMTOR活性化を抑制しました。我々のデータは、AMPKが初期のMTOR阻害媒介オートファジーとAkt/MTORシグナル伝達軸の後期活性化の両方を介してヒト間葉系幹細胞の骨形成分化を制御することを示しています。

We investigated the role of AMP-activated protein kinase (AMPK), Akt, mammalian target of rapamycin (mTOR), autophagy and their interplay in osteogenic differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells. The activation of various members of AMPK, Akt and mTOR signaling pathways and autophagy was analyzed by immunoblotting, while osteogenic differentiation was assessed by alkaline phosphatase staining and real-time RT-PCR/immunoblot quantification of osteocalcin, Runt-related transcription factor 2 and bone morphogenetic protein 2 mRNA and/or protein levels. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells was associated with early (day 1) activation of AMPK and its target Raptor, coinciding with the inhibition of mTOR and its substrate p70S6 kinase. The early induction of autophagy was demonstrated by accumulation of autophagosome-bound LC3-II, upregulation of proautophagic beclin-1 and a decrease in the selective autophagic target p62. This was followed by the late activation of Akt/mTOR at days 3-7 of differentiation. The RNA interference-mediated silencing of AMPK, mTOR or autophagy-essential LC3β, as well as the pharmacological inhibitors of AMPK (compound C), Akt (10-DEBC hydrochloride), mTOR (rapamycin) and autophagy (bafilomycin A1, chloroquine and ammonium chloride), each suppressed mesenchymal stem cell differentiation to osteoblasts. AMPK knockdown prevented early mTOR inhibition and autophagy induction, as well as late activation of Akt/mTOR signaling, while Akt inhibition suppressed mTOR activation without affecting AMPK phosphorylation. Our data indicate that AMPK controls osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells through both early mTOR inhibition-mediated autophagy and late activation of Akt/mTOR signaling axis.