固定化された金属アフィニティークロマトグラフィーは、TGF-β1をヒスチジンタグ付き組換え細胞外タンパク質と共重量化します

細胞外組換えタンパク質は、HEK293細胞を使用して一般的に生成され、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）による精製を促進するヒスチジンタグ付きタンパク質として産生されます。ゲル分析に基づいて、このワンステップ精製は通常、高純度のタンパク質を生成します。ここでは、例として組換え細胞外フィブリリン-1断片を使用して、このようなiMac精製におけるTGF-β1の存在を分析しました。ELISAによるさまざまな精製組換えフィブリリン-1断片の分析により、BMP-2の活性および潜在性TGF-β1のピコモル濃度の存在が一貫して明らかになりました。これらの量のTGF-β1は、ウエスタンブロッティングと質量分析により検出できませんでした。しかし、TGF-β1の量は、線維芽細胞のSMAD2リン酸化を一貫してトリガーするのに十分でした。精製メカニズムを分析して、これらのタンパク質製剤におけるTGF-β1の存在が、フィブリリン-1フラグメントを使用したTGF-β1の特定または非固有の共培養を表しているかどうかを判断しました。非トランスフェクト293細胞からの条件付き培地を使用したコントロール精製により、IMAC後に同量のTGF-β1が得られました。精製されたTGF-β1および潜時関連ペプチドのIMACは、これらのタンパク質が固定化されたニッケルイオンに結合したことを示しました。これらのデータは、TGF-β1がニッケルとの特定の相互作用により、フィブリリン-1フラグメントとの特定の相互作用ではなく共培養されたことを明確に示しています。フィブリリン-1調製からTGF-β1を排除する能力についてテストされたさまざまなクロマトグラフィー方法の中で、高塩条件下でのゲルろ過は非常に効果的でした。この方法で精製されたさまざまな組換え細胞外タンパク質が、TGF-β1の存在によって影響を受ける可能性のある実験に頻繁に使用されるため、これらの発見は、必要なクロマトグラフィースキームと品質管理に広範囲に影響を及ぼします。

Extracellular recombinant proteins are commonly produced using HEK293 cells as histidine-tagged proteins facilitating purification by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). Based on gel analyses, this one-step purification typically produces proteins of high purity. Here, we analyzed the presence of TGF-β1 in such IMAC purifications using recombinant extracellular fibrillin-1 fragments as examples. Analysis of various purified recombinant fibrillin-1 fragments by ELISA consistently revealed the presence of picomolar concentrations of active and latent TGF-β1, but not of BMP-2. These quantities of TGF-β1 were not detectable by Western blotting and mass spectrometry. However, the amounts of TGF-β1 were sufficient to consistently trigger Smad2 phosphorylation in fibroblasts. The purification mechanism was analyzed to determine whether the presence of TGF-β1 in these protein preparations represents a specific or non-specific co-purification of TGF-β1 with fibrillin-1 fragments. Control purifications using conditioned medium from non-transfected 293 cells yielded similar amounts of TGF-β1 after IMAC. IMAC of purified TGF-β1 and the latency associated peptide showed that these proteins bound to the immobilized nickel ions. These data clearly demonstrate that TGF-β1 was co-purified by specific interactions with nickel, and not by specific interactions with fibrillin-1 fragments. Among various chromatographic methods tested for their ability to eliminate TGF-β1 from fibrillin-1 preparations, gel filtration under high salt conditions was highly effective. As various recombinant extracellular proteins purified in this fashion are frequently used for experiments that can be influenced by the presence of TGF-β1, these findings have far-reaching implications for the required chromatographic schemes and quality controls.