T47D乳がん細胞によるビオチン摂取：ナトリウム依存性マルチビタミン輸送体（SMVT）の機能的および分子的証拠

この研究の目的は、乳がん（T47D）細胞におけるビオチン摂取の原因となるキャリア媒介システムの機能的および分子的証拠を調査し、このトランスポーターの細胞内調節のメカニズムを描写することでした。[3H]ビオチンの細胞蓄積は、T47Dおよび正常な乳腺上皮（MCF-12A）細胞で研究されました。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を実施して、T47D細胞におけるナトリウム依存性マルチビタミン輸送体（SMVT）の分子発現を確認しました。T47DおよびMCF-12A細胞におけるSMVTの相対的な発現を比較するために、定量的リアルタイムPCR分析も実行されました。[3H] T47D細胞によるビオチン摂取は、9.24μMのK（M）および27.34 pmol/mgタンパク質/minのV（最大）に依存する濃度であることがわかった。MCF-12A細胞への[3H]ビオチンの取り込みも濃度依存性および飽和性であることがわかりましたが、比較的高いK（M）（53.10μM）があり、乳がんと比較して正常乳房細胞におけるビオチンの取り込みの親和性の減少を示しています。セル。[3H]ビオチンの摂取は、時間、温度、pH、およびナトリウムイオン依存性であるが、エネルギーおよび塩化物イオンに依存しないようです。[3H]ビオチンの取り込みは、その構造類似体デスティオビオン、パントテン酸、リポ酸の存在下で有意に阻害されました。ビオチン摂取の濃度依存性阻害は、遊離カルボキシル基とビオシチンとNHSビオチンを持つバリック酸の存在下で明らかでした。構造的に無関係なビタミン（アスコルビン酸、葉酸、ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、リボフラビン）の存在下では、有意な阻害は観察されませんでした。PTK、PKC、およびPKA媒介経路のモジュレーターは効果がありませんでしたが、カルモダゾリウム（カルシウムカルモジュリン阻害剤）の存在下での摂取は有意に阻害されました。[3H]マルコダゾリウムの存在下でのビオチンの摂取は、それぞれ13.49μmおよび11.20 pmol/mgタンパク質/minのK（M）およびV（MAX）値で飽和していることがわかった。774 bpのSMVT mRNAのバンドは、RT-PCR分析によって特定されました。定量的リアルタイムPCRは、MCF-12A細胞と比較して、T47D細胞におけるSMVTのより高い発現を確認しました。これらすべての研究は、ヒト由来乳がん（T47D）細胞におけるビオチン摂取用の特定のキャリア媒介システムであるナトリウム依存性マルチビタミン輸送体（SMVT）の機能的および分子的発現を初めて実証しました。本研究はまた、癌細胞が高い増殖状態を維持するために、おそらく正常な乳房細胞と比較してより多くのビタミンを輸入できることを示した。この細胞株（T47D）をin vitro細胞培養モデルとして選択する可能性を調査して、ビオチン結合抗癌薬/薬物送達システムを研究しました。

The objective of this study was to investigate functional and molecular evidence of carrier mediated system responsible for biotin uptake in breast cancer (T47D) cells and to delineate mechanism of intracellular regulation of this transporter. Cellular accumulation of [3H] biotin was studied in T47D and normal mammary epithelial (MCF-12A) cells. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was carried out to confirm the molecular expression of sodium dependent multivitamin transporter (SMVT) in T47D cells. Quantitative real time PCR analysis was also performed to compare the relative expression of SMVT in T47D and MCF-12A cells. [3H] biotin uptake by T47D cells was found to be concentration dependent with K(m) of 9.24 μM and V(max) of 27.34 pmol/mg protein/min. Uptake of [3H] biotin on MCF-12A cells was also found to be concentration dependent and saturable, but with a relatively higher K(m) (53.10 μM) indicating a decrease in affinity of biotin uptake in normal breast cells compared to breast cancer cells. [3H] biotin uptake appears to be time-, temperature-, pH- and sodium ion-dependent but independent of energy and chloride ions. [3H] biotin uptake was significantly inhibited in the presence of biotin, its structural analog desthiobiotin, pantothenic acid and lipoic acid. Concentration dependent inhibition of biotin uptake was evident in the presence of valeric acid which possesses free carboxyl group and biocytin and NHS biotin which are devoid of free carboxyl group. No significant inhibition was observed in the presence of structurally unrelated vitamins (ascorbic acid, folic acid, nicotinic acid, thiamine, pyridoxine and riboflavin). Modulators of PTK, PKC and PKA mediated pathways had no effect, but uptake in presence of calmidazolium (calcium-calmodulin inhibitor) was significantly inhibited. [3H] biotin uptake in the presence of calmidazolium was found to be saturable with a K(m) and V(max) values of 13.49 μM and 11.20 pmol/mg protein/min, respectively. A band of SMVT mRNA at 774 bp was identified by RT-PCR analysis. Quantitative real time PCR confirmed higher expression of SMVT in T47D cells relative to MCF-12A cells. All these studies demonstrated for the first time the functional and molecular expression of sodium dependent multivitamin transporter (SMVT), a specific carrier-mediated system for biotin uptake, in human derived breast cancer (T47D) cells. The present study also indicated that cancer cells could import more vitamin compared to normal breast cells possibly for maintaining high proliferative status. We investigated the likelihood of selecting this cell line (T47D) as an in vitro cell culture model to study biotin-conjugated anti-cancer drugs/drug delivery systems.