リン酸化されたタウタンパク質に対する超特異的鳥類抗体は、ホスホエピトープ認識のユニークなメカニズムを明らかにしています

ホスホエピトープに対する高度に特異的な抗体は、疾患状態のリン酸化を研究するための貴重なツールですが、それらの発見は主に経験的であり、リン特異的結合を媒介する分子メカニズムはよく理解されていません。ここでは、アルツハイマー病関連タンパク質タウの3つのホスホエピトープに対する非常に特異的な組換え鶏抗体の生成と特性評価を報告します。各抗体は、単一のホスホペプチドに対して完全な特異性を示しています。キメラIgG PT231/PS235_1は、同種のホスホペプチドに結合する1：1で0.35 nmのK（D）を示します。このIgGはマウスのオーソログクロス反応性であり、アルツハイマー病患者の脳サンプルとタオパシーのマウスモデルにおけるタウの病理学的形態を具体的に認識しています。このような顕著な特異性を可能にする基礎となる結合メカニズムをよりよく理解するために、1.9Å分解能で同種のホスホペプチドとともに複合体のPT231/PS235_1 FABの構造を決定しました。FABフラグメントは、ペプチド認識を媒介する長いジスルフィドで構成されたCDR-H3と同様に、ホスホ-THR-231リン酸グループと密接かつ具体的に相互作用するCDR-H2の「ボウルのような」立体構造を備えた、新しい相補性決定領域（CDR）構造を示します。この結合メカニズムは、これまでに説明されているペプチドまたはハプテン特異的抗体のいずれかとはっきりと異なります。表面プラズモン共鳴分析により、PT231/PS235_1は、リン酸化Ser-235も遊離ペプチドも測定可能な結合親和性を示さないため、真に複合エピトープに結合することが示されました。

Highly specific antibodies to phosphoepitopes are valuable tools to study phosphorylation in disease states, but their discovery is largely empirical, and the molecular mechanisms mediating phosphospecific binding are poorly understood. Here, we report the generation and characterization of extremely specific recombinant chicken antibodies to three phosphoepitopes on the Alzheimer disease-associated protein tau. Each antibody shows full specificity for a single phosphopeptide. The chimeric IgG pT231/pS235_1 exhibits a K(D) of 0.35 nm in 1:1 binding to its cognate phosphopeptide. This IgG is murine ortholog-cross-reactive, specifically recognizing the pathological form of tau in brain samples from Alzheimer patients and a mouse model of tauopathy. To better understand the underlying binding mechanisms allowing such remarkable specificity, we determined the structure of pT231/pS235_1 Fab in complex with its cognate phosphopeptide at 1.9 Å resolution. The Fab fragment exhibits novel complementarity determining region (CDR) structures with a "bowl-like" conformation in CDR-H2 that tightly and specifically interacts with the phospho-Thr-231 phosphate group, as well as a long, disulfide-constrained CDR-H3 that mediates peptide recognition. This binding mechanism differs distinctly from either peptide- or hapten-specific antibodies described to date. Surface plasmon resonance analyses showed that pT231/pS235_1 binds a truly compound epitope, as neither phosphorylated Ser-235 nor free peptide shows any measurable binding affinity.