義務的なライゲーションゲート組換え（obligare）：非相同例の結合を介したカスタム設計のヌクレアーゼ媒介標的統合

カスタム設計されたヌクレアーゼ（CDN）は、ゲノムで標的DNA二本鎖切断（DSB）を生成することにより、遺伝子工学を大幅に促進します。DSBが作成されると、2つの主要なDNA損傷修復（DDR）メカニズムにより、修復中に破損部位の周りに特定の変更を導入できます。支配的であるがエラーが発生しやすい非隔離末端結合（NHEJ）経路、およびそれほど頻繁ではあるが正確です相同組換え（HR）経路。ここでは、効率的なNHEJ経路を使用し、HRとは無関係に作用する部位固有の遺伝子挿入の新しい方法であるObligareについて説明します。この方法は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）と物語ヌクレアーゼ（TALENS）の両方で適用でき、ヒト細胞株の定義された遺伝子座で15 kBの誘導性遺伝子発現カセットを挿入することができました。さらに、我々の実験により、以前に過小評価されていたNHEJのエラーのない性質が明らかになり、生理学的および病理学的条件下でこの経路をさらに特徴付ける新しいツールを提供しました。

Custom-designed nucleases (CDNs) greatly facilitate genetic engineering by generating a targeted DNA double-strand break (DSB) in the genome. Once a DSB is created, specific modifications can be introduced around the breakage site during its repair by two major DNA damage repair (DDR) mechanisms: the dominant but error-prone nonhomologous end joining (NHEJ) pathway, and the less-frequent but precise homologous recombination (HR) pathway. Here we describe ObLiGaRe, a new method for site-specific gene insertions that uses the efficient NHEJ pathway and acts independently of HR. This method is applicable with both zinc finger nucleases (ZFNs) and Tale nucleases (TALENs), and has enabled us to insert a 15-kb inducible gene expression cassette at a defined locus in human cell lines. In addition, our experiments have revealed the previously underestimated error-free nature of NHEJ and provided new tools to further characterize this pathway under physiological and pathological conditions.