クローンコロニーの分割およびアッセイのためのマイクロファブリケートアレイ

マイクロファブリケートされたプラットフォームは、非常に平行で効率的なコロニーピッキング、分割、およびクローン識別のために開発されました。パレットアレイは、サポートベースと取り付けられたポストによって形成された微細構造で構成される2番目の印刷アレイと交配するパターン化された細胞コロニーを提供しました。この投稿により、最初にパレットアレイで培養されたコロニーからの哺乳類細胞が、印刷アレイ上の対応する部位に移動することができました。配列の分離は、コロニーを同時に分割し、パターン化されたレプリカを作成します。アレイ要素の最適化により、直径30μmの長さ100μmのブリッジングポストと3000の総コロニー数を使用して90％を超える移動効率が得られました。5つの哺乳類細胞株を使用した研究は、さまざまな接着細胞タイプが培養され、78〜92％の印刷効率で効果的に分裂できることを示しました。技術の有用性を実証するために、コロニン1bのsiRNAノックダウンを伴うクローン細胞株をアレイを使用して生成し、従来のFACS/ウエスタンブロッティングベースのアプローチと比較しました。標的クローンの同定は、shRNAコンストラクトの干渉の成功によってもたらされたコロニン1bの欠如との細胞を識別するために破壊的なアッセイを必要としました。小型化とその並列形式により、プラットフォームは、3900セルの開始サンプルからの12のターゲットクローンの識別と生成を可能にし、11日間で5人の時間のみを必要としました。対照的に、従来の方法では500,000セルが必要であり、47日間にわたって34人の時間を費やした5つのターゲットクローンのみを生成しました。これらのデータは、破壊的なアッセイと従来のアプローチによるクローン選択のための小型化されたプラットフォームを使用して、時間、人材、および試薬の大幅な短縮をサポートします。

A microfabricated platform was developed for highly parallel and efficient colony picking, splitting, and clone identification. A pallet array provided patterned cell colonies which mated to a second printing array composed of bridging microstructures formed by a supporting base and attached post. The posts enabled mammalian cells from colonies initially cultured on the pallet array to migrate to corresponding sites on the printing array. Separation of the arrays simultaneously split the colonies, creating a patterned replica. Optimization of array elements provided transfer efficiencies greater than 90% using bridging posts of 30 μm diameter and 100 μm length and total colony numbers of 3000. Studies using five mammalian cell lines demonstrated that a variety of adherent cell types could be cultured and effectively split with printing efficiencies of 78-92%. To demonstrate the technique's utility, clonal cell lines with siRNA knockdown of Coronin 1B were generated using the arrays and compared to a traditional FACS/Western Blotting-based approach. Identification of target clones required a destructive assay to identify cells with an absence of Coronin 1B brought about by the successful infection of interfering shRNA construct. By virtue of miniaturization and its parallel format, the platform enabled the identification and generation of 12 target clones from a starting sample of only 3900 cells and required only 5 man hours over 11 days. In contrast, the traditional method required 500,000 cells and generated only 5 target clones with 34 man hours expended over 47 days. These data support the considerable reduction in time, manpower, and reagents using the miniaturized platform for clonal selection by destructive assay versus conventional approaches.