ヒト誘導多能性幹細胞および胚性幹細胞のための新しい抗体は、過剰硫酸化構造を欠いている硫酸ケラタンのタイプを認識しています

ヒト誘導多能性幹（HIPS）/胚性幹細胞（HES）細胞（HES）に特異的なモノクローナル抗体（R-10G）を抗原として使用して、股関節とヒト胚のマウスハイブリドーマの微分スクリーニングを生成しました。癌（HEC）細胞。R-10Gでウエスタンブロットすると、hips/es細胞溶解物は、250 kDaを> 250 kDaに対応する位置に単一が異常に拡散したバンドを与えました。抗原タンパク質は、R-10gの親和性カラムを持つ誘導多能性幹（IPS）細胞溶解物から分離されました。R-10g陽性バンドは、ペプチドN-グリカーカーカーゼF（PnGase F）、ニューラミニダーゼ、フコシダーゼ、コンドロチナーゼABCおよびヘパリナーゼ混合を使用した消化に耐性がありましたが、ケラタナーゼ、ケラタナーゼIIおよびエンドβ-ガラクトシダーゼ、ケラタナーゼ、エンドβ-ガラクトシダーゼとの消化によりほぼ完全に消失しました。R-10gエピトープが硫酸ケラタンであることを示しています。R-10Gエピトープの担体タンパク質は、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS/MS）分析により、ポドカリキシンとして同定されました。）。R-10Gエピトープは、いくつかのユニークな特性を備えた硫酸塩の一種です。（1）エピトープは、従来のHIPS/ESマーカー抗体によって認識されているものとは異なり、HEP/ES細胞でのみ、つまりHEC細胞では発現しません。（2）エピトープは、過剰硫酸化構造を欠いている硫酸ケラタンの一種であり、高硫酸化ケラタン硫酸塩と免疫学的に交差反応性ではありません。（3）R-10Gエピトープは、股関節細胞に不均一に分布しており、未分化の股関節細胞の単一コロニーが異なる細胞サブタイプで構成されていることを示唆しています。したがって、R-10Gは、HIPS/ES細胞を認識する新規抗体であり、これらの細胞でのグリカンの役割を開示するための新しい分子プローブである必要があります。

We have generated a monoclonal antibody (R-10G) specific to human induced pluripotent stem (hiPS)/embryonic stem (hES) cells by using hiPS cells (Tic) as an antigen, followed by differential screening of mouse hybridomas with hiPS and human embryonal carcinoma (hEC) cells. Upon western blotting with R-10G, hiPS/ES cell lysates gave a single but an unusually diffuse band at a position corresponding to >250 kDa. The antigen protein was isolated from the induced pluripotent stem (iPS) cell lysates with an affinity column of R-10G. The R-10G positive band was resistant to digestion with peptide N-glycanase F (PNGase F), neuraminidase, fucosidase, chondrotinase ABC and heparinase mix, but it disappeared almost completely on digestion with keratanase, keratanase II and endo-β-galactosidase, indicating that the R-10G epitope is a keratan sulfate. The carrier protein of the R-10G epitope was identified as podocalyxin by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS/MS) analysis of the R-10G positive-protein band material obtained on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The R-10G epitope is a type of keratan sulfate with some unique properties. (1) The epitope is expressed only on hiPS/ES cells, i.e. not on hEC cells, unlike those recognized by the conventional hiPS/ES marker antibodies. (2) The epitope is a type of keratan sulfate lacking oversulfated structures and is not immunologically cross-reactive with high-sulfated keratan sulfate. (3) The R-10G epitope is distributed heterogeneously on hiPS cells, suggesting that a single colony of undifferentiated hiPS cells consists of different cell subtypes. Thus, R-10G is a novel antibody recognizing hiPS/ES cells, and should be a new molecular probe for disclosing the roles of glycans on these cells.