筋芽細胞の遺伝操作と新規原発性ミオサテライト細胞培養システム：アプローチの比較と最適化

in vitroでの骨格筋細胞の遺伝的操作は、特に未分化の筋肉細胞株（筋芽細胞）または原発性筋肉幹細胞（ミオサテライト）を使用する場合に困難であることで有名です。したがって、マウスC2C12細胞および新規系である一次虹色のトラウトミオサテライト細胞における緑色蛍光タンパク質（GFP）を過剰発現することにより、遺伝子移動の方法を最適化しました。一般的な脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して（Lipofectamine 2000）、3つの異なるウイルスベクター：アデノ関連ウイルス血清型2（AAV2）、バキュロウイルス（BAC）、およびレンチウイルスを使用しました。細胞密度と試薬：DNA比を最適化した後、C2C12細胞では49％の最大トランスフェクション効率が得られましたが、GFPシグナルは急速に増殖で消散し、分化で維持されませんでした。AAV2の形質導入効率は、インキュベーション時間を延長し、細胞密度を低下させることにより65％に最適化されましたが、通過後に発現を保持した細胞の30％のみが発現しました。ウイルスの比較により、レンチウイルスはC2C12筋芽細胞を導入するのに最も効率的であることが明らかになりました。97％の細胞は10（6）ウイルスゲノム（VG）のみで導入され、54％が10（8）AAV2、23％が10（9）で23％であることが明らかになりました。VG BAC。レンチウイルスはまた、AAV2およびBACで1〜10％と比較して、一次トラウトミオサテライトの90％を導入しました。ホスホグリセル酸キナーゼ1（PGK）プロモーターは、C2C12細胞の即時エアリープロモーターよりも10倍活性が高く、両方ともトラウトミオサテライトで効果的でした。C2C12筋管の最大変換は、以前にレンチウイルスとPGKプロモーターを導入した筋芽細胞を区別することにより達成されました。したがって、最適化されたプロトコルは、多様な筋肉細胞系で非常に効果的であることが証明されたため、共通の技術的障壁を克服するのに役立ちます。

The genetic manipulation of skeletal muscle cells in vitro is notoriously difficult, especially when using undifferentiated muscle cell lines (myoblasts) or primary muscle stem cells (myosatellites). We therefore optimized methods of gene transfer by overexpressing green fluorescent protein (GFP) in mouse C2C12 cells and in a novel system, primary rainbow trout myosatellite cells. A common lipid-based transfection reagent was used (Lipofectamine 2000) along with three different viral vectors: adeno-associated virus serotype 2 (AAV2), baculovirus (BAC) and lentivirus. Maximal transfection efficiencies of 49% were obtained in C2C12 cells after optimizing cell density and reagent : DNA ratio, although the GFP signal rapidly dissipated with proliferation and was not maintained with differentiation. The transduction efficiency of AAV2 was optimized to 65% by extending incubation time and decreasing cell density, although only 30% of cells retained expression after passing. A viral comparison revealed that lentivirus was most efficient at transducing C2C12 myoblasts as 97% of cells were transduced with only 10(6) viral genomes (vg) compared to 54% with 10(8) vg AAV2 and 23% with 10(9) vg BAC. Lentivirus also transduced 90% of primary trout myosatellites compared to 1-10% with AAV2 and BAC. The phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoter was 10-fold more active than the cytomegalovirus immediate-early promoter in C2C12 cells and both were effective in trout myosatellites. Maximal transduction of C2C12 myotubes was achieved by differentiating myoblasts previously transduced with lentivirus and the pgk promoter. Thus, our optimized protocol proved highly effective in diverse muscle cell systems and could therefore help overcome a common technological barrier.