パルス化された電磁場は、モノマック6細胞株培養における固有および小胞体網膜アポトーシス誘導経路に影響を与えます

現在の研究は、細胞生存率とアポトーシス誘導経路に対するパルス電磁面刺激の影響を解明することを目的としていました。実験モデルでは、単球細胞株モノマック6と、プロマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、ミノサイクリン、過酸化水素などの異なる死誘導メカニズムを持ついくつかのアポトーシス誘導を選択しました。Monomac6細胞株は、96ウェル培養プレートで密度1x10（5）細胞/ウェルで成長しました。細胞死細胞培養を誘導するために、プロマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、ミノサイクリン、過酸化水素などの異なるアポトーシス誘導因子で処理され、同時にパルス電界50 Hz、45±5 mt（PEMF）で、刺激ごとに3回、3回、24時間間隔で3回、パルスしました。その後、アネキシンV-APC標識およびヨウ化プロピジウム染色によって測定された細胞生存率のフローサイトメトリー分析のために細胞を採取しました。アポトーシス関連遺伝子の発現は、半定量的逆転写（RT）-PCRアッセイによって評価されました。Nupage Novexウエスタンブロット分析は、モノマック細胞のサイトゾルおよび核抽出物におけるアポトーシス誘導因子（AIF）の存在量のために実施されました。Puromycin、ColchicineおよびMinocycline活性化細胞と同時にPEMFで処理されたことで、PEMF刺激のないコントロールと比較して、Annexinv陽性（ANV+）細胞の割合が減少していることが示されています。モナマック細胞のプロマイシン/コルチシンおよびPEMF処理されたPEMFは、非刺激コントロールよりも壊死性（PI+）細胞と同様に後期アポトーシスおよび壊死性（PI+）細胞の増加を意味します。一方、PEMF処理前のミノサイクリン活性化細胞は、アポトーシスと壊死の量の減少を示した（アネキシンV、アネキシンVおよびヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム陽性染色）細胞。アネキシンVの陽性染色細胞の割合に対するPEMFの逆の効果は、シクロフォスハミドおよび過酸化水素によるモノマック培養の処理後に達成されました。PEMFは、両方のアポトーシス誘導剤によって誘発されるアポトーシスの初期段階を強化しました。Puromycinで処理され、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイの逆転写で実行されたPEMFにさらされたモノマック培養におけるアポトーシス関連遺伝子の発現の分析は、AIF存在を持つ内因性アポトーシス経路と経路に関与する遺伝子のmRNAの変化を示しています。最も影響を受けたのは、Bcl-2およびAIFエージェントのアポトーシス促進ファミリーに属する遺伝子の発現でした。抗AIF抗体を使用して発生した免疫ブロットの検査により、AIFタンパク質のサイトゾル含有量は、PuromycinおよびPEMF処理後にMonomac6細胞のPEMF処理後に減少することが示されました。得られた結果は、PEMFが死亡に刺激されたモノマック6細胞のアポトーシスの誘導に影響を及ぼし、患者を異なる程度まで誘導することを示しています。現在の結果の主な発見は、プロマイシンで処理されたモノマック6細胞のPEMF刺激により、Bcl-family遺伝子の発現とアポトーシス誘導因子のカスパーゼ独立経路（AIF）の変化が生じたことです。

Current studies were aimed to elucidate influence of pulsed electromagnetic field stimulation on cell viability and apoptosis induction pathways. For the experimental model we have chosen monocytic cell line MonoMac6 and several apoptosis inducers with different mechanism of death induction like puromycin, colchicine, cyclophosphamide, minocycline and hydrogen peroxide. MonoMac6 cell line was grown at density 1x10(5) cells/well in 96-well culture plates. To induce cell death cell cultures were treated with different apoptosis inducers like puromycin, colchicine, cyclophosphamide, minocycline, hydrogen peroxide and at the same time with pulsed electromagnetic field 50 Hz, 45±5 mT (PEMF) for 4 hour per each stimulation, three times, in 24 hours intervals. Afterwards, cells were harvested for flow cytometry analysis of cell viability measured by annexin V-APC labeled and propidium iodide staining. Expression of apoptosis related genes was evaluated by semi quantitative reverse transcription (RT)-PCR assay. NuPAGE Novex Western blot analysis was carried out for apoptosis inducing factor (AIF) abundance in cytosolic and nuclear extracts of MonoMac6 cells. Puromycin, colchicine and minocycline activated cells and simultaneously treated with PEMF have shown out diminished percentage of annexinV positive (AnV+) cells comparing to controls without PEMF stimulation. MonaMac6 cells puromycin/colchicyne and PEMF treated were to a higher extent double stained (AnV+,PI+), which means increased late apoptotic as well as necrotic (PI+) cells, than non-stimulated controls. On the other hand, minocycline activated cells prior to PEMF treatment showed diminished amount of apoptotic and necrotic (annexin V, annexin V and propidium iodide, propidium iodide positive staining) cells. The opposite effect of PEMF on the percentage of annexin V positively stained cells has been achieved after treatment of MonoMac6 culture with cyclophoshamide and hydrogen peroxide. PEMF enhanced early phase of apoptosis induced by both apoptosis inducing agents. The analysis of expression of the apoptosis related genes in MonoMac6 cultures treated with puromycin and exposed to PEMF performed in reverse transcription of polymerase chain reaction (PCR) assay has shown changes in mRNA of genes engaged in intrinsic apoptotic pathway and pathway with AIF abundance. The most influenced was expression of gene belonging to pro-apoptotic family of Bcl-2 and AIF agent. Examination of immunoblots developed with anti-AIF antibody showed that cytosol content of AIF protein was diminished after puromycin and PEMF treatment of MonoMac6 cells. The obtained results indicate that PEMF affects induction of apoptosis in MonoMac6 cells stimulated to death with inducing agents to a different extent. Main finding of the current results is that, PEMF stimulation of MonoMac6 cells simultaneously treated with puromycin caused changes in the Bcl-family genes expression as well as in caspase independent pathway of apoptosis inducing factor (AIF).