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ヌクレオチドピロフォスファターゼ/ホスホジエステラーゼ（NPP）の活性とNPP阻害剤のスクリーニングを監視するために、高感度の毛細管電気泳動法が開発されました。この方法では、p-ニトロフェニル5'-チミジンモノリン酸（p-NPH-5'-TMP）を人工基質として使用し、反応産物の分離を動的にコーティングした毛細血管で行いました。最適な毛細血管電気泳動（CE）条件は次のとおりであることがわかりました：融合シリカ毛細血管（20cm有効長×75.5μm（ID））、60Sの電気動態注射、ポリブレン0.002％、pH 9.2、-80μAの一定の毛細血管は400NMの一定の毛細血管を含む70mmリン酸緩衝液を含む。正確な定量化を可能にするために、内部標準として2-メチル-4,6-ジニトロフェノール（ジニトロクレソール）が適用されました。検出の限界（LOD）と定量化の限界（LOQ）は、それぞれ137および415Nmでした。この新しい方法は、従来の分光光度計アッセイよりも8倍以上の感度が高く、以前に報告されたCE手順よりも16倍高いことが示されており、NPP1およびNPP3の結果（K（M）値、取得した標準阻害剤のK（I）値は以前の文献データに従っていました。したがって、この新しい方法は実際の手法の改善であり、NPP阻害剤の識別と特性評価のための迅速かつ標準的な分析手法として使用できます。
ヌクレオチドピロフォスファターゼ/ホスホジエステラーゼ（NPP）の活性とNPP阻害剤のスクリーニングを監視するために、高感度の毛細管電気泳動法が開発されました。この方法では、p-ニトロフェニル5'-チミジンモノリン酸（p-NPH-5'-TMP）を人工基質として使用し、反応産物の分離を動的にコーティングした毛細血管で行いました。最適な毛細血管電気泳動（CE）条件は次のとおりであることがわかりました：融合シリカ毛細血管（20cm有効長×75.5μm（ID））、60Sの電気動態注射、ポリブレン0.002％、pH 9.2、-80μAの一定の毛細血管は400NMの一定の毛細血管を含む70mmリン酸緩衝液を含む。正確な定量化を可能にするために、内部標準として2-メチル-4,6-ジニトロフェノール（ジニトロクレソール）が適用されました。検出の限界（LOD）と定量化の限界（LOQ）は、それぞれ137および415Nmでした。この新しい方法は、従来の分光光度計アッセイよりも8倍以上の感度が高く、以前に報告されたCE手順よりも16倍高いことが示されており、NPP1およびNPP3の結果（K（M）値、取得した標準阻害剤のK（I）値は以前の文献データに従っていました。したがって、この新しい方法は実際の手法の改善であり、NPP阻害剤の識別と特性評価のための迅速かつ標準的な分析手法として使用できます。
A highly sensitive capillary electrophoresis method has been developed to monitor the activity of nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (NPPs) and screen for NPP inhibitors. In this method, p-nitrophenyl 5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) was used as an artificial substrate, and separation of reaction products was performed on a dynamically coated capillary. We found that the optimal capillary electrophoresis (CE) conditions were as follows: fused-silica capillary (20cm effective length×75.5μm (id)), electrokinetic injection for 60s, 70mM phosphate buffer containing polybrene 0.002%, pH 9.2, constant current of -80μA, constant capillary temperature of 15°C and detection at 400nm. To allow precise quantification, 2-methyl-4,6-dinitrophenol (dinitrocresol) was applied as an internal standard. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were 137 and 415nM, respectively. This new method was shown to be over 8-fold more sensitive than the conventional spectrophotometric assays and 16-fold more than the previously reported CE procedure, and the results (K(m) values for NPP1 and NPP3, K(i) values for standard inhibitors) obtained were in accordance with previous literature data. Therefore, this new method is an improvement of actual techniques and could be used as a quick and standard analytical technique for the identification and characterization of NPP inhibitors.
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