イントロン含有マーカー遺伝子の構築：トランスジェニック植物におけるイントロンのスプライシングと、アグロバクテリウム媒介植物変換の初期イベントの監視におけるその使用

Agrobacterium Tumefaciensは、双子葉植物を変換するための一般的に使用されるツールです。しかし、根本的な変換のメカニズムはあまりよく理解されていません。このメカニズムの分析を複雑にしている1つの問題は、ほとんどの指標遺伝子がすでにアグロバクテリウムで活性であるため、植物細胞へのT-DNA移動のタイミングと局在の正確な決定を妨げるという事実です。この障害を克服するために、修正された原核生物のインジケーター遺伝子が構築されました。この指標遺伝子の発現と、アグロバクテリウムを介した植物形質転換の初期イベントの分析におけるその使用について説明します。植物のイントロンに由来するポータブルイントロンがベータ - グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子に導入されました。このキメア遺伝子を含むトランスジェニック植物では、イントロンが効率的にスプライシングされ、Gus酵素活性が生じます。スプライスジャンクションのマッピングは、イントロンの正確な除去を示します。原核生物に真核生物のスプライシング装置が不足しているため、この構造を含むアグロバクテリアではGUS活性は検出されません。シロイヌナズナ子葉植片の形質転換後の初期段階は、このGus-intronキマリック遺伝子を使用して分析されました。形質転換細胞のin vivo gus染色は、主に切断された表面で、gus活性を発現するgus活性を迅速に増殖させることが形成されることを明確に示しています。ただし、マイナーな変換イベントは、子葉全体を通して発生します。これらのデータは、植物へのアグロバクテリウム媒介T-DNA移転は、選択がすぐに適用される実験から判断されたよりもはるかに効率的であることを示しています。イントロンを含むGUS遺伝子は、過渡的および安定した形質転換実験で最適化されたマーカー遺伝子として使用できます。

Agrobacterium tumefaciens is a commonly used tool for transforming dicotyledonous plants. The underlying mechanism of transformation however is not very well understood. One problem complicating the analysis of this mechanism is the fact that most indicator genes are already active in Agrobacterium, thereby preventing the precise determination of timing and localisation of T-DNA transfer to plant cells. In order to overcome this obstacle a modified prokaryotic indicator gene was constructed. The expression of this indicator gene and its use in analysing early events in Agrobacterium-mediated plant transformation are described. A portable intron, derived from a plant intron, was introduced into the beta-glucuronidase (GUS) gene. In transgenic plants containing this chimaeric gene the intron is spliced efficiently, giving rise to GUS enzymatic activity. Mapping of the splice junction indicates the exact removal of the intron. No GUS activity is detected in agrobacteria containing this construct due to the lack of a eukaryotic splicing apparatus in prokaryotes. Early phases after transformation of Arabidopsis cotyledon explants were analysed using this GUS-intron chimaeric gene showing that as early as 36 h after Agrobacterium infection significant GUS activity is detected. In vivo GUS staining of transformed cells clearly shows that quickly proliferating calli expressing GUS activity are formed, mainly at the cut surface. Minor transformation events occur however throughout the whole cotyledon. These data indicate that Agrobacterium-mediated T-DNA transfer to plants is much more efficient than has been judged from experiments where selection is applied immediately. The intron-containing GUS gene can be used as an optimised marker gene in transient and stable transformation experiments.