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標的抗がん療法は、治療に反応する可能性が最も高い患者サブグループの特定に依存しています。予測バイオマーカーは患者の選択において重要な役割を果たしますが、診断と予後のバイオマーカーは腫瘍生物学の理解を拡大し、治療の組み合わせを示唆し、新しい薬物標的の発見を促進します。TaqManまたは対立遺伝子特異的PCR（AS-PCR）アッセイに基づいて、突然変異検出（MUT-MAP、Mutation Multi-Analyteパネル）のためのハイスループットマイクロフルイディクス法を開発しました。治療上の関心のある6つの遺伝子にわたる71の変異のセットを分析しました。6遺伝子変異パネルは、EGFR、KRAS、PIK3CA、NRAS、BRAF、およびAkt1癌遺伝子の最も一般的な変異を検出するように設計されました。DNAは、BioMark Microfluidicsシステム（Fluidigm; South San Francisco、CA）を使用して、Taqman/AS-PCRアッセイを使用して実行する前に、カスタム設計のプライマーセットを使用して前述しました。交差反応性分析により、堅牢な自動化された突然変異コールアルゴリズムの生成が可能になり、その後、一連の51個の細胞株と33個のFFPE臨床サンプルで検証されました。検出されたすべての変異は、他の手段によって確認されました。サンプル入力滴定により、わずか2 ng GDNAでアッセイ感度が確認され、優れたチップおよびチップ内の再現性が示されました。92の臨床試験サンプルの並列分析は、2-100 ngゲノムDNA（GDNA）を使用して実行され、複数の変異の同時検出を可能にしました。新鮮な冷凍およびホルマリン固定の両方のパラフィン包埋（FFPE）サンプルから調製したDNAを使用し、分析は2〜3日で定期的に完了しました。分析します。このアッセイは、非常に少量のサンプルDNAからの治療的に関連する遺伝子の幅広い変異を検出できます。そのため、開発された突然変異アッセイは、ハイスループットバイオマーカーの発見と個別化医療と癌薬物開発における検証のための貴重なツールです。
標的抗がん療法は、治療に反応する可能性が最も高い患者サブグループの特定に依存しています。予測バイオマーカーは患者の選択において重要な役割を果たしますが、診断と予後のバイオマーカーは腫瘍生物学の理解を拡大し、治療の組み合わせを示唆し、新しい薬物標的の発見を促進します。TaqManまたは対立遺伝子特異的PCR（AS-PCR）アッセイに基づいて、突然変異検出（MUT-MAP、Mutation Multi-Analyteパネル）のためのハイスループットマイクロフルイディクス法を開発しました。治療上の関心のある6つの遺伝子にわたる71の変異のセットを分析しました。6遺伝子変異パネルは、EGFR、KRAS、PIK3CA、NRAS、BRAF、およびAkt1癌遺伝子の最も一般的な変異を検出するように設計されました。DNAは、BioMark Microfluidicsシステム（Fluidigm; South San Francisco、CA）を使用して、Taqman/AS-PCRアッセイを使用して実行する前に、カスタム設計のプライマーセットを使用して前述しました。交差反応性分析により、堅牢な自動化された突然変異コールアルゴリズムの生成が可能になり、その後、一連の51個の細胞株と33個のFFPE臨床サンプルで検証されました。検出されたすべての変異は、他の手段によって確認されました。サンプル入力滴定により、わずか2 ng GDNAでアッセイ感度が確認され、優れたチップおよびチップ内の再現性が示されました。92の臨床試験サンプルの並列分析は、2-100 ngゲノムDNA（GDNA）を使用して実行され、複数の変異の同時検出を可能にしました。新鮮な冷凍およびホルマリン固定の両方のパラフィン包埋（FFPE）サンプルから調製したDNAを使用し、分析は2〜3日で定期的に完了しました。分析します。このアッセイは、非常に少量のサンプルDNAからの治療的に関連する遺伝子の幅広い変異を検出できます。そのため、開発された突然変異アッセイは、ハイスループットバイオマーカーの発見と個別化医療と癌薬物開発における検証のための貴重なツールです。
Targeted anticancer therapies rely on the identification of patient subgroups most likely to respond to treatment. Predictive biomarkers play a key role in patient selection, while diagnostic and prognostic biomarkers expand our understanding of tumor biology, suggest treatment combinations, and facilitate discovery of novel drug targets. We have developed a high-throughput microfluidics method for mutation detection (MUT-MAP, mutation multi-analyte panel) based on TaqMan or allele-specific PCR (AS-PCR) assays. We analyzed a set of 71 mutations across six genes of therapeutic interest. The six-gene mutation panel was designed to detect the most common mutations in the EGFR, KRAS, PIK3CA, NRAS, BRAF, and AKT1 oncogenes. The DNA was preamplified using custom-designed primer sets before the TaqMan/AS-PCR assays were carried out using the Biomark microfluidics system (Fluidigm; South San Francisco, CA). A cross-reactivity analysis enabled the generation of a robust automated mutation-calling algorithm which was then validated in a series of 51 cell lines and 33 FFPE clinical samples. All detected mutations were confirmed by other means. Sample input titrations confirmed the assay sensitivity with as little as 2 ng gDNA, and demonstrated excellent inter- and intra-chip reproducibility. Parallel analysis of 92 clinical trial samples was carried out using 2-100 ng genomic DNA (gDNA), allowing the simultaneous detection of multiple mutations. DNA prepared from both fresh frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) samples were used, and the analysis was routinely completed in 2-3 days: traditional assays require 0.5-1 µg high-quality DNA, and take significantly longer to analyze. This assay can detect a wide range of mutations in therapeutically relevant genes from very small amounts of sample DNA. As such, the mutation assay developed is a valuable tool for high-throughput biomarker discovery and validation in personalized medicine and cancer drug development.
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