モノソジウム尿酸塩は、SRC/PYK2/PI3キナーゼとカテプシン依存性のない型にはまらないタンパク質分泌を活性化します。

尿酸単骨（MSU）は、損傷した細胞から放出された尿酸から結晶化された内因性の危険シグナルです。MSUはマクロファージで炎症反応を活性化することが知られていますが、関係する分子メカニズムは特徴のままです。活性化されたマクロファージは、タンパク質を分泌して免疫応答を活性化し、感染および/または組織損傷の部位に他の免疫細胞を動員します。自然免疫系の活性化後のセクレトームの特性評価は、防衛反応の初期段階の詳細を解明するために不可欠です。ここでは、定量的2次元GEL電気泳動ベースのプロテオミクスと、SDS-PAGEと液体クロマトグラフィーによるタンパク質同定によるタンパク質分離を組み合わせた高スループット定性的GELC-MS/MSアプローチを使用して、MSUで刺激されたヒト原発性マクロファージのセクレタムを分析しました。MS/MS。どちらの方法でも、MSU刺激がリポ多糖で実成されたヒトマクロファージからの堅牢なタンパク質分泌を誘発することを示しました。Secretomeデータのバイオインフォマティック分析は、MSU刺激が型にはまらない小胞を介したタンパク質分泌を強く活性化することを示しました。型破りに分泌されたタンパク質には、IL-1βやIL-18などの炎症誘発性サイトカイン、インターフェロン誘発性タンパク質、および危険シグナルタンパク質が含まれていました。また、リソソームプロテアーゼの活性型カテプシンはMSU刺激で分泌され、カテプシン活性はMSU誘発性の型にはまらないタンパク質分泌に不可欠でした。さらに、SRCファミリーチロシンキナーゼを含むリン酸化イベントに関連するタンパク質は、MSU刺激細胞のセクレタムで増加しました。我々の機能研究は、SRC、PYK2、およびPI3キナーゼがカテプシンの上流に作用して、マクロファージからのタンパク質全体の分泌を活性化することを実証しました。結論として、ヒトマクロファージでMSUによって活性化されたタンパク質分泌経路の最初の包括的な特性評価を提供し、型破りなタンパク質分泌の活性化におけるカテプシンとSRC、PYK2、PI3キナーゼの新しい役割を明らかにします。

Monosodium urate (MSU) is an endogenous danger signal that is crystallized from uric acid released from injured cells. MSU is known to activate inflammatory response in macrophages but the molecular mechanisms involved have remained uncharacterized. Activated macrophages start to secrete proteins to activate immune response and to recruit other immune cells to the site of infection and/or tissue damage. Secretome characterization after activation of innate immune system is essential to unravel the details of early phases of defense responses. Here, we have analyzed the secretome of human primary macrophages stimulated with MSU using quantitative two-dimensional gel electrophoresis based proteomics as well as high-throughput qualitative GeLC-MS/MS approach combining protein separation by SDS-PAGE and protein identification by liquid chromatography-MS/MS. Both methods showed that MSU stimulation induced robust protein secretion from lipopolysaccharide-primed human macrophages. Bioinformatic analysis of the secretome data showed that MSU stimulation strongly activates unconventional, vesicle mediated protein secretion. The unconventionally secreted proteins included pro-inflammatory cytokines like IL-1β and IL-18, interferon-induced proteins, and danger signal proteins. Also active forms of lysosomal proteases cathepsins were secreted on MSU stimulation, and cathepsin activity was essential for MSU-induced unconventional protein secretion. Additionally, proteins associated to phosphorylation events including Src family tyrosine kinases were increased in the secretome of MSU-stimulated cells. Our functional studies demonstrated that Src, Pyk2, and PI3 kinases act upstream of cathepsins to activate the overall protein secretion from macrophages. In conclusion, we provide the first comprehensive characterization of protein secretion pathways activated by MSU in human macrophages, and reveal a novel role for cathepsins and Src, Pyk2, PI3 kinases in the activation of unconventional protein secretion.