蛍光寿命分析とマグネシウムイオンの効果NADHのヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼへの結合1

アルデヒドデヒドロゲナーゼ1（Aldh1a1）は、毒性アルデヒドのカルボン酸への酸化を触媒します。Mg（2+）イオンの生理学的レベルは、酵素へのNADH結合親和性を増加させることにより、ALDH1活性を部分的に減少させます。時間分解蛍光分光法を使用することにより、溶液中の遊離NADHの蛍光寿命（τ）と2つの酵素結合NADH状態（τ= 2.0 nsおよびτ= 7.7 ns）を解決しました。この手法を使用して、ALDH1A1-NADH結合特性と酵素触媒に対するMg（2+）イオンの効果を調査しました。分解された自由で結合したNADH蛍光シグネチャから、ALDH1A1の両方のNADH立体構造のKD値は、それぞれ0〜6000μMのMg（2+）イオン濃度で約24μmから1μmの範囲でした。酵素NADH複合体の解離の速度定数は、NADHの再分類を防ぎ、リアルタイムNADH蛍光シグナルを解決するために、過剰なNAD（+）の添加により決定されるように、0.03秒（-1）（6000μmmg（2+））から0.30（-1）（0μmmg（2+））の範囲でした。酵素とNAD（+）およびブチルアルデヒドとの最初の反応中に、結合したNADH複合体の形成により、NADH蛍光が即座に上昇し、自由NADHの生産率が一定になりました。Mg（2+）イオン濃度が増加するにつれて、0.31 s（-1）（0μmmg（2+））から0.050 s（-1）（6000μmmg（2+））からの酵素触媒回転率の一貫した減少があり、ALDH1-NADHとの安定状態の適合集団での定常状態の適合集団の異なるシフト（過剰）マグネシウムイオンは、6000μmmg（2+）でより長い蛍光寿命（13％過剰）でAldh1-Nadh複合体を好むものに存在する。より高いMg（2+）イオン濃度での立体構造集団のこのシフトと酵素活性の低下は、ALDH1ポケットのNADHの滞留時間が長いためである可能性があります。マグネシウムの非存在下での酵素触媒を監視した結果は、より短い蛍光寿命を持つAldh1-Nadh複合体が最初に生成された形態であり、より長い蛍光寿命を持つ複合体が異性化によって生成されることを示唆しています。

Aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1A1) catalyzes the oxidation of toxic aldehydes to carboxylic acids. Physiologic levels of Mg(2+) ions decrease ALDH1 activity in part by increasing NADH binding affinity to the enzyme. By using time-resolved fluorescence spectroscopy, we have resolved the fluorescent lifetimes (τ) of free NADH in solution (τ=0.4 ns) and two enzyme-bound NADH states (τ=2.0 ns and τ=7.7 ns). We used this technique to investigate the effects of Mg(2+) ions on the ALDH1A1-NADH binding characteristics and enzyme catalysis. From the resolved free and bound NADH fluorescence signatures, the KD values for both NADH conformations in ALDH1A1 ranged from about 24 μM to 1 μM for Mg(2+) ion concentrations of 0-6000 μM, respectively. The rate constants for dissociation of the enzyme-NADH complex ranged from 0.03 s(-1) (6000 μM Mg(2+)) to 0.30s(-1) (0 μM Mg(2+)) as determined by addition of excess NAD(+) to prevent re-association of NADH and resolving the real-time NADH fluorescence signal. During the initial reaction of enzyme with NAD(+) and butyraldehyde, there was an immediate rise in the NADH fluorescence, due to the formation of bound NADH complexes, with a constant steady-state rate of production of free NADH. As the Mg(2+) ion concentration was increased, there was a consistent decrease of the enzyme catalytic turnover from 0.31 s(-1) (0 μM Mg(2+)) to 0.050 s(-1) (6000 μM Mg(2+)) and a distinct shift in steady-state conformational population from one that favors the ALDH1-NADH complex with the shorter fluorescence lifetime (33% excess) in the absence of magnesium ion to one that favors the ALDH1-NADH complex with the longer fluorescence lifetime (13% excess) at 6000 μM Mg(2+). This shift in conformational population at higher Mg(2+) ion concentrations and to lower enzyme activity may be due to longer residence time of the NADH in the ALDH1 pocket. The results from monitoring enzyme catalysis in the absence of magnesium suggests that the ALDH1-NADH complex with the shorter fluorescence lifetime is the form initially produced, and the complex with the longer fluorescence lifetime is produced through isomerization.