Nutlin ‑ 3誘導ミトコンドリアのp53のミトコンドリア転座によって媒介されるERK1/2活性化

Nutlin-3は、マウスの2回の瞬間2（MDM2）の小分子拮抗薬であり、p53への結合をブロックし、p53タンパク質レベルの増加をもたらします。腫瘍抑制因子P53は、遺伝毒性ストレスに応答して成長停止またはアポトーシスを誘導します。その成長抑制効果に加えて、p53はヘパリン結合表皮成長因子様成長因子（HB-EGF）のアップレギュレーションを介してマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路を刺激することが報告されています。（EGFR）リガンド、および転写レベルでのチロシンキナーゼ受容体であるディスコイドドメイン受容体1（DDR1）。この研究では、p53誘発MAPK活性化に関与する新しいメカニズムを提案します。Nutlin-3は、野生型p53を抱えるヒト骨肉腫細胞で、EGFR、MAPK/ERKキナーゼ（MEK）1/2および細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）1/2のリン酸化を誘導しました。このリン酸化は、p53 siRNAによって完全に阻害されましたが、p53のトランスクリプショナル活性の阻害剤であるピフィスリン（PFT）-αによっては阻害されませんでした。Nutlin-3誘導のEGFRリン酸化は、ERK1/2の不活性化によって防止されましたが、EGFRリン酸化がEGFR siRNAおよびAG1478を使用してEGFRリン酸化が阻害された細胞では、NUTLIN-3誘発MEK1/2-ERK1/2リン酸化がまだ観察されました。、EGFRチロシンキナーゼの阻害剤。注目すべきことに、Nutlin-3はミトコンドリア反応性酸素種（ROS）の蓄積を引き起こし、これはp53のミトコンドリア転座と相関していました。ROSスカベンジャーである2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリディンロキシ（TEMPO）は、ERK1/2のリン酸化を防ぎました。p53のミトコンドリア局在を防止したPFT-μは、ERK1/2リン酸化を抑制し、ROS蓄積を抑制しました。最後に、Nutlin-3誘導アポトーシスに対するERK1/2活性化の効果を分析しました。MEK1/2およびERK1/2活性のノックダウン、MEK阻害剤、またはsiRNAを使用したERK1/2活性は、Nutlin-3誘導アポトーシスの強化をもたらしました。さらに、TempoとPFT-μはNutlin-3誘発アポトーシスも促進しました。上記の発見を考慮して、Nutlin-3は、p53のミトコンドリア転座後のROS生成を介してEGFRリン酸化の前にERK1/2を活性化すると結論付けることができます。p53依存性アポトーシスからの細胞は、p53誘導アポトーシスの負のフィードバックループを構成します。

Nutlin-3 is a small-molecule antagonist of murine double minute 2 (MDM2) that blocks its binding to p53, leading to an increase in p53 protein levels. The tumor suppressor p53 induces growth arrest or apoptosis in response to genotoxic stress. Along with its growth-suppressive effect, it has been reported that p53 stimulates the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway via the upregulation of heparin- binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF), an epidermal growth factor receptor (EGFR) ligand, and discoidin domain receptor 1 (DDR1), a tyrosine kinase receptor, at the transcription level. In this study, we propose a novel mechanism involved in the p53-induced MAPK activation. Nutlin-3 induced the phosphorylation of EGFR, MAPK/ERK kinase (MEK)1/2 and extracellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 in U2OS human osteosarcoma cells harboring wild-type p53. This phosphorylation was completely inhibited by p53 siRNA, but not by pifithrin (PFT)-α, an inhibitor of the trans-criptional activity of p53. While the nutlin-3-induced EGFR phosphorylation was prevented by the inactivation of ERK1/2, the nutlin-3-induced MEK1/2-ERK1/2 phosphorylation was still observed in the cells in which EGFR phosphorylation was inhibited using EGFR siRNA and AG1478, an inhibitor of EGFR tyrosine kinase. Of note, nutlin-3 caused the accumulation of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and this correlated with the mitochondrial translocation of p53. 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy (TEMPO), a ROS scavenger, prevented the phosphorylation of ERK1/2. PFT-μ, which prevented the mitochondrial localization of p53, suppressed ERK1/2 phosphorylation, as well as ROS accumulation. Finally, we analyzed the effect of ERK1/2 activation on nutlin-3-induced apoptosis. The knockdown of MEK1/2 and ERK1/2 activity using U0126, a MEK inhibitor, or siRNAs, resulted in the enhancement of nutlin-3-induced apoptosis. In addition, TEMPO and PFT-μ also promoted nutlin-3-induced apoptosis. Taking the above findings into account, it can be concluded that nutlin-3 activates ERK1/2 prior to EGFR phosphorylation via ROS generation following the mitochondrial translocation of p53 and that nutlin-3-induced ERK1/2 activation may play a role in protecting U2OS cells from p53-dependent apoptosis, constituting a negative feedback loop for p53-induced apoptosis.