血清中の血小板因子4のN末端処理されたアイソフォームの定量的パターン分析

理論的根拠：血小板因子4（PF4）は、炎症や血管新生の調節に役割を果たすことが示されているCXCケモカインファミリーに属する小さなサイトカインです。一般に、ケモカインはアミノおよびカルボキシ末端領域のタンパク質分解切断の影響を受けやすく、通常はケモカインの生物活性に劇的な変化をもたらします。この研究の目的は、タンパク質分解処理によって引き起こされるさまざまな血小板因子4（PF4）アイソフォームを特定し、正常血清のレベルを定量化することでした。 方法：最初に、質量分析（MS）およびタンデム質量分析（MS/MS）分析を使用して、標準精製PF4タンパク質サンプルからのN末端が切り捨てられたPF4アイソフォームを特定しました。次に、血清サンプルからPF4を半育成するために高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用し、ナノLC/TRIPLE-の選択された反応モニタリング（SRM）アッセイを使用して、最も豊富な4つのPF4アイソフォームのレベルを定量的に決定しました。四重極質量分析計。 結果：7つのN末端処理されたPF4アイソフォームを特定し、9つの血清サンプルの主要なPF4アイソフォームのレベルを比較しました。Pro-P1（EaeeDGDLQCLCVK-;平均MW、7765.2）は血清の主要なPF4アイソフォームですが、PF4アイソフォーム、指定されたPROT-P4（FASAEAEDGDLQCLCVK-;平均MW、8141.5）、PROT-P3（SAEEEDLQCVK-;平均MW;、およびProT-P2（AeeDGDLQCLCVK-;平均MW、7836.3）は、それぞれ主要なレベルの約16％、3％、および2％レベルです。 結論：この研究は、血清中のN末端処理されたPF4アイソフォームのレベルに関する最初の報告です。また、この研究は、タンパク質アイソフォームバリアントの濃度を決定する際のSRMの有用性を示しています。

RATIONALE: Platelet factor 4 (PF4) is a small cytokine belonging to the CXC chemokine family which has been shown to play a role in inflammation and in the regulation of angiogenesis. In general, chemokines are susceptible to proteolytic cleavage in amino and carboxy terminal regions, which usually results in dramatic changes to the chemokine bioactivity. The purpose of this study was to identify various platelet factor-4 (PF4) isoforms caused by proteolytic processing and to quantify their levels in normal serum. METHODS: First, we identified the N-terminally truncated PF4 isoforms from a standard purified PF4 protein sample by using mass spectrometry (MS) and tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis. Then, we used high-performance liquid chromatography (HPLC) to semi-purify PF4 from serum samples, and the levels of the four most abundant PF4 isoforms were quantitatively determined using selected reaction monitoring (SRM) assays on a nano-LC/triple-quadrupole mass spectrometer. RESULTS: We have identified seven N-terminally processed PF4 isoforms and compared the levels of major PF4 isoforms from nine serum samples. Pro-p1 (EAEEDGDLQCLCVK-; average MW, 7765.2) is the major PF4 isoform in serum whereas the PF4 isoforms, designated Prot-p4 (FASAEAEEDGDLQCLCVK-;average MW, 8141.5), Prot-p3 (SAEAEEDGDLQCLCVK-; average MW, 7923.3), and Prot-p2 (AEEDGDLQCLCVK- ; average MW, 7836.3), are at about 16%, 3%, and 2% levels of the major one, respectively. CONCLUSIONS: This study is the first report on the levels of N-terminally processed PF4 isoforms in serum. Also, this study shows the usefulness of SRM in determining concentrations of protein isoform variants, which can be often overlooked in immunoassay analysis.