共有結合したダイマイズ科の抗ヒューマンTNFA酵母pichia pastorisで発現したシングルドメイン抗体は、優れた中和活性を示します

腫瘍壊死因子アルファ（TNFA）の拮抗薬は、選択された炎症性疾患の治療に革命をもたらしました。組換えcameLidae可変重鎖ドメインのみのTNFA抗体（抗TNF-VHH）は、ヒトおよびマウスTNFAの作用に敵対するために開発されました。ここでは、抗TNF-VHH-FCという名前のヒトIgG1 FCドメインのC末端融合を伴う機能的共有結合ダイマー抗TNF-VHH分子を取得する戦略について説明します。得られた融合タンパク質は、Escherichia coli（（EC））株BL21のPET28AベクターとPichia Pastoris（（PP））株GS115のPPICZAAベクターを使用して、タンパク質Aアフィニティ樹脂で精製することにより、個別に発現しました。FCエンジニアリング抗（EC）TNF-VHH-FCは約40 kDaで、抗（PP）TNF-VHH-FCは約43 kDaでした。また、モノマーVHHはクローン化され、大腸菌株BL21で発現し、分子量は約18 kDaでした。酵素結合免疫吸着剤アッセイおよびL929細胞細胞毒性アッセイにより、融合タンパク質抗（PP）TNF-VHH-FCがTNF-VHH-FCまたはモノマー抗（EC）TNF-VHHタンパク質よりも効果的にTNFA活性をブロックしたことが示されました。P. pastoris発現システムを使用した効率的なジスルフィド結合形成により、共有ダイマー抗TNF-VHHHHH中和活性が改善されることをお勧めします。

Antagonists of tumor necrosis factor alpha (TNFa) have revolutionized the treatment of selected inflammatory diseases. Recombination Camelidae variable heavy-chain domain-only TNFa antibodies (anti-TNF-VHH) have been developed to antagonize the action of human and murine TNFa. Here, we describe a strategy to obtain functional covalent dimer anti-TNF-VHH molecules with the C-terminal fusion of human IgG1 Fc domain named anti-TNF-VHH-Fc. The resulting fusion proteins were separately expressed by use of the pET28a vector in Escherichia coli ((Ec)) strain BL21 and the pPICZaA vector in Pichia pastoris ((Pp)) strain GS115, then purified by protein A affinity resin. Fc-engineered anti-(Ec)TNF-VHH-Fc was about 40 kDa and anti-(Pp)TNF-VHH-Fc was about 43 kDa. Monomeric VHH was also cloned and expressed in E. coli strain BL21, with the molecular weight of about 18 kDa. Enzyme-linked immunosorbent assay and L929 cell cytotoxicity assay demonstrated that the fusion protein anti-(Pp)TNF-VHH-Fc blocked TNFa activity more effectively than either anti-(Ec)TNF-VHH-Fc or monomeric anti-(Ec)TNF-VHH protein. We suggest that efficient disulfide bond formation using the P. pastoris expression system improves the covalent dimer anti-TNF-VHH-Fc neutralizing activity.