Na+/H+交換体1がATP結合タンパク質であるという証拠

Na（+）/H（+）交換器（NHE）1は、細胞内イオン性恒常性を調節する溶質キャリアスーパーファミリーのメンバーです。NHE1は、ATP加水分解からのエネルギー入力の要件がないにもかかわらず、その活動に細胞ATPを必要とすることが知られています。この研究では、NHE1がATP結合タンパク質であるかどうかを調査しました。エピトープタグ付きNHE1とそのサイトゾルサブユニットCHP1の両方を運ぶバキュロウイルスベクターを設計し、SF9昆虫細胞の表面に機能性NHE1-CHP1複合体を発現しました。SF9細胞からのNHE1とCHP1からなる精製された複雑なタンパク質を使用して、8-アジド-ATP-ビオチンとの光アフィニティ標識反応を調べました。UV照射により、8-アジド-ATPのNHE1への取り込みが促進されましたが、Mg（2+）の存在下で29.1 µmの見かけのkdがありました。非ラベルヌクレオチドATP、GTP、TTP、およびCTPはすべて、この架橋を阻害しました。ただし、ATPは最も強い阻害効果があり、ATP 2.2 mmで明らかな阻害定数（IC50）があり、ATP濃度に近いNHE1活性の半最大活性化が得られました。重要なことに、架橋はADPよりもATPの方が強く阻害され、ATPがATP加水分解時にNHE1から解離することを示唆しています。トロンビンおよび欠失変異体分析による限られたタンパク質分解により、8-アジド-ATP結合部位はNHE1のC末端細胞質ドメイン内にあることが明らかになりました。NHE1由来のペプチドによる平衡透析は、ATPがNHE1のATP依存性調節に重要な近位細胞質領域（Gly542-Pro598）に直接結合するという証拠を提供しました。これらの発見は、NHE1がATP結合トランスポーターであることを示唆しています。したがって、ATPはNHE1の直接アクティベーターとして機能する場合があります。

Na(+)/H(+) exchanger (NHE) 1 is a member of the solute carrier superfamily, which regulates intracellular ionic homeostasis. NHE1 is known to require cellular ATP for its activity, despite there being no requirement for energy input from ATP hydrolysis. In this study, we investigated whether NHE1 is an ATP-binding protein. We designed a baculovirus vector carrying both epitope-tagged NHE1 and its cytosolic subunit CHP1, and expressed the functional NHE1-CHP1 complex on the surface of Sf9 insect cells. Using the purified complex protein consisting of NHE1 and CHP1 from Sf9 cells, we examined a photoaffinity labeling reaction with 8-azido-ATP-biotin. UV irradiation promoted the incorporation of 8-azido-ATP into NHE1, but not into CHP1, with an apparent Kd of 29.1 µM in the presence of Mg(2+). The nonlabeled nucleotides ATP, GTP, TTP and CTP all inhibited this crosslinking. However, ATP had the strongest inhibitory effect, with an apparent inhibition constant (IC50) for ATP of 2.2 mM, close to the ATP concentration giving the half-maximal activation of NHE1 activity. Importantly, crosslinking was more strongly inhibited by ATP than by ADP, suggesting that ATP is dissociated from NHE1 upon ATP hydrolysis. Limited proteolysis with thrombin and deletion mutant analysis revealed that the 8-azido-ATP-binding site is within the C-terminal cytoplasmic domain of NHE1. Equilibrium dialysis with NHE1-derived peptides provided evidence that ATP directly binds to the proximal cytoplasmic region (Gly542-Pro598), which is critical for ATP-dependent regulation of NHE1. These findings suggest that NHE1 is an ATP-binding transporter. Thus, ATP may serve as a direct activator of NHE1.